蛋白翻译后修饰研究的问题探讨

访谈简介

蛋白翻译后修饰(Post-translational modification,简称PTM)指蛋白质在翻译后的化学修饰。PTMScan®是一项专门用于蛋白翻译后修饰(PTM)研究的蛋白质组学技术,利用针对蛋白质翻译后修饰(PTM)基序(motif)抗体, 在肽段水平上免疫亲和富集带有不同PTM的肽段,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行定量分析,能够快速、准确、高通量地分析多种疾病相关信号通路关键节点蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化和 泛素化修饰的变化,满足创新性研究、生物标志物鉴定、药物靶点筛选和评价的需求。PTMScan技术能够鉴定新的蛋白修饰位点,并且为蛋白功能研究开辟新的方向,是下一代蛋白质组学研究重要分支和趋势。
 
本期访谈邀请到CST学术经理李振亚博士,主要围绕蛋白翻译后修饰PTMScan技术为各位答疑解惑。
李振亚博士简介:
2002-2008 协和医科大学 获得博士学位
2008-2010在中国科学院生物物理研究所从事博士后研究
2010至今任CST学术经理,长期从事PTMScan研究策略和技术培训,具有丰富的信号通路研究技术经验,希望能够在实验工作中助您一臂之力。
 
另外,由于涉及丝/苏氨酸修饰的motif抗体数量比较多,因此在磷酸化蛋白质修饰分析(Phosphoscan service)之前,通常会建议首先进行激酶组学扫描Westernblot分析(Kinomeview),利用不同的motif抗体分别对不同处理后的蛋白质样本进行Westernblot分析,来观察各组WB条带是否存在明显差异,来确定磷酸化修饰的变化与哪些磷酸化motif有关,再选择相应的motif抗体进行后续免疫亲和层析和质谱分析。
 
所以本期访谈也荣幸的邀请到了丁香园论坛资深站友(ID:fangweibin119)来为大家解答WB流程中遇到的各种问题,欢迎大家踊跃提问。
 
综上,本次访谈将持续开放,您可以随时提问,李博士和方版主会在6月15日集中回答问题,之后两位专家会定期不定期的长期回答各位老师的技术问题。欢迎踊跃提问,如您期望指定其中某一位嘉宾作答,可以在提问时仅@该嘉宾用户名。
 
参与有奖:
所有提问者均可获得CST提供的三通道计时器实验室专用Maker夏日灵动小风扇(三种礼品任选一种),部分用户还有机会获得motif抗体试用装获取办法:向本次活动主持人(ID:cstchina)发送站内信索取,写上您的寄送地址和期望礼品,CST工作人员就会在2个工作日内为您安排寄送了。
 
相关链接:
PTMScan® 蛋白质组学服务

细胞信号学院系列活动

 

访谈时间: 06月15日 - 12月31日

   嘉宾回答(共43个问题,47个回复)
  1. 小白too
    小白too  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:最近在做WB,有几个技巧问一下:1,转膜时间是越长越好吗?总感觉大蛋白转膜不理想,尤其是红色的70kDa的Marker处难转过去;2,有的师兄说二抗不容易杂上,而且在之后的洗膜过程中容易洗掉,所以显过一次影想再次时,需要重新孵育二抗??时间怎么把握呢?
  2. katherineliu1
    katherineliu1  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:您好,问一个关于cst抗体的问题。CST的p-p53(#9286)抗体是针对于wild type的还是mutant type的? 看说明书上没有说,我自己做实验的情况是突变型的p53 WB做的出来,但是野生型的p53 WB没有条带。这个抗体是野生型和突变型p53都可以检测到吗?谢谢!!!
    edwardlichina  : 要根据突变位点来确定,CST抗体有特定的识别序列。
  3. 小白too
    小白too  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:WB:1,转膜时间越长越好吗?怎么改善提高大蛋白转过去?2,显影一次后需要重新显影,需要重新孵育二抗吗?据师兄说二抗本来就不易杂上,容易洗脱。3,求Strip buffer的配方和使用方法,之前用师姐的,洗脱不均匀
    edwardlichina  : 1、转膜时间不是越长越好,对于大蛋白,需要适当延长,同时用比较薄的胶,0.5mm或者1mm的胶,另外需要及时更换新鲜的转膜液。 2、重新显影,和strip的条件有关,一般都是室温处理30分钟 3、对于strip配方,100 mM beta-mercapto-ethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl pH 6.8
  4. 赤色涟漪
    赤色涟漪  :@fangweibin119 提问:您好,我想咨询您关于血浆蛋白做westernblot分析的技术问题,我所测的目的蛋白分子量在15KD左右,但是含量较低,属于pg级别,若不稀释,泳道不齐,背景都很高,条带比较模糊,稀释后泳道好一些但是条带仍然比较模糊,请问这种情况能够通过优化实验条件改善或解决?谢谢
    edwardlichina  : 利用血浆蛋白纯化试剂盒来提取就好了,订一个专用的试剂盒。
  5. 心宁1989
    心宁1989  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:老师,我目前在做P53的western blot ,在正常细胞中低表达,在肿瘤细胞中高表达,然后进行p53测序。无论是正常的还是肿瘤细胞中均有突变点发生,但在肿瘤细胞中突变点只是把一种酸性氨基酸变成了另一种酸性氨基酸,为什么肿瘤细胞中p53蛋白水平那么高呢?
    edwardlichina  : p53在肿瘤中表达高,与肿瘤发生过程密切相关,大多数是因为肿瘤恶性增殖且基因组不稳定性大大增加,导致内部信号通路反馈造成p53的表达迅速升高。
  6. pabc
    pabc  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:我想提取30000Da左右的蛋白,其是用一个依赖半胱氨酸二硫键固定的双链,您能给我一些纯化的提示么?
    edwardlichina  : 纯化时,不可以加一些破坏二硫键的试剂,比如ME、DTT都不可以加。
  7. DXY721
    碳酸镧  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:提取贴壁细胞蛋白做WB,看同学是除去培养液,然后加裂解液,再用细胞刮子刮刮,再吸到EP管里,离心去上清,定量,煮沸再做,为什么不能用胰酶先把细胞消化下来,离心,弃上清,再加裂解液呢?刮也不能保证全部刮下来,那么蛋白不就损失了么?
    edwardlichina  : 这是一个经典的问题:1、因为很多信号通路的蛋白,多带有修饰,且发生快速,在用胰酶处理的过程中会有可能丢失,造成测定结果的不稳定;2、胰酶对细胞毕竟有伤害,有可能对一些蛋白的构象产生影响。 用细胞刮子去刮,的确不可能把所有细胞都刮下来,但只要能够把部分细胞刮下来,蛋白表达或修饰的平均水平就已经可以很好的测定,所以不必担心。
  8. wjl976412741
    wjl976412741  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:我在做磷酸化蛋白组,沉淀复溶用碳酸氢铵无法溶解,改用ULB(尿素,硫脲CHAPS)溶解再用碳酸氢铵稀释尿素浓度为1M以下,用去污剂去除树脂,后用Strata-X脱盐,发现效果较好,但有几个ULB的峰,我用SCX分离,脱盐干燥用C18液相检测,那几个峰还是存在,怎么办
    edwardlichina  : 我们一般的操作方法是用8M尿素的方法来提取蛋白,请参看我们的protocol,或许可以有所帮助 http://dxy.me/7jq6zi
  9. 海洋一乐者
    乡间小路143号  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:老师你好!我刚做Western Blot实验不久,我想问的是在ECL显影后,目的条带上下有时候会出现很浅的条带,听师兄师姐说这是被修饰的目的蛋白条带,我的问题是怎么确定是否是目的条带还是杂带?另外在灰度统计的时候这些条带是否一起统计?
    edwardlichina  : 需要一起统计,因为同属一个蛋白的不同组分。
  10. 册-路痴
    册-路痴  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:老师您好,我目前在做p53分子的WB,结果显示杂带很多,且背景不干净,但相同条件下跑出的内参很好,修改了二抗稀释比后,结果仍不理想,请问是否与p53分子的磷酸化有关?
    edwardlichina  : p53会有多种修饰,如果临近的几个条带相邻很近,属于正常现象,无虑。
  11. 北京764321254
    北京764321254  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:两位专家,您们好!我们正在研究的一种药物对细胞的某种蛋白磷酸化的影响,我们发现该种药物能激活细胞的两条信号通路,但是我们的实验仅仅需要其中的一条通路激活,而另外一条通路被抑制,我们希望摸索出一种合适的浓度能够达到我们的要求,这种方法可行吗?
    edwardlichina  : 此问题属于开放性问题,也有报道某些药物可能存在多靶点,但根据您的描述,可能性不大。
  12. xc_wang
    xc_wang  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:李振亚博士您好,我需要使用WB检测乙酰化的P65,组织来源为小鼠脑组织,如检测磷酸化的蛋白在进行蛋白提取时需要加磷酸化酶抑制剂,那么对于乙酰化的检测组织需不需要进行特殊化处理?
    edwardlichina  : 要看研究的目的,如果要衡量p65的乙酰化水平,一般不会去刻意利用特殊处理来保持p65的乙酰化,即在自然状态下去检测乙酰化含量。 但如果是定性检测,需要确定是否发生相关的乙酰化,那可能会用到一些HDAC抑制剂来提高乙酰化水平。
  13. benjimmy33108
    benjimmy33108  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:fangweibin119前辈,您好。我想请教一个WB方面的问题,我前一阶段在做磷酸化抗体孵育的时候,总是有时候条带能够出来,有时候又出不来?跑胶,抗体等条件什么的都是一样的,不知道该如何分析处理这种问题。
    edwardlichina  : 这个有可能与样品制备有关,因为磷酸化的修饰往往在不同的信号刺激下才会出现,如果刺激不当,或取材时间不对,都有可能造成上述现象。
  14. 土土的另类
    土土的另类  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:您好!我在研究一个基因会参与哪些信号通路的哪些步骤,起先会外源转入该基因然后western孵总的p-Thr/p-Ser抗体,在有明显变化的条带的大小位置上预测可能的基因。那么我想问的是,乙酰化、甲基化的研究能不能这样,有没有总的乙酰化或甲基化的抗体?谢谢!
    edwardlichina  : 有,CST有总的acetyl-lysine抗体,9814 甲基化无法,因为甲基化本身分arginine和lysine两个位点,又细分为单、二和三甲基化,所以必须分别去研究。 具体请看http://dxy.me/63q2Av
  15. 游刃有余-xiaobao
    游刃有余-xiaobao  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:李博士您好,我有2个问题: 若某种疾病,机制研究中有比较明确的几种蛋白磷酸化异常,此时液相色谱-串联质谱定量分析有哪些具体意义;此项技术主要是明确既往未知蛋白修饰异常么; 若motif抗体得到的条带不能确定何种蛋白,那如何进行特定motif抗体去做IAP呢
    edwardlichina  : 当某些疾病相关的磷酸化蛋白比较明确时,利用质谱主要也是发现一些新的修饰位点; 此项技术主要是对新的修饰位点进行鉴定,但肯定也会包含将既往已经发现的位点,两者并不矛盾。 motif抗体也只能提供一些基本的条带分布情况的比较,就是用WB来简单分析是否有条带分布的差异,但无法确定是何种蛋白,只有确定跟此种motif相关后,才会利用此种motif在进一步对所有蛋白肽段进行富集纯化,对相关修饰的肽段进行鉴定。详见我们的网站,有比较细节的说明, http://dxy.me/E3263e
  16. tiaopimimi
    徐徐清风来  :@fangweibin119 提问:版主您好,最近在做P-nephrin的WB,最后曝光的胶片上,只有很淡很淡的一条目的条带,由于之前未做过磷酸化相关蛋白,请问版主如何才能提高磷酸蛋白检测的浓度
    edwardlichina  : 最好的办法就是:1、增加上样量,2、增加抗体的浓度,3,使用增强ECL底物发光液来进行曝光
  17. yanglinsen
    yanglinsen  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:李振亚博士您好,我在研究一个260kd的一个蛋白sumo化修饰,请问有没有什么好的方法可以快速的找到修饰位点?像这么大的蛋白(260kd)有没有比较好用瞬时表达载体在哺乳动物细胞中瞬时表达的?
    edwardlichina  : 主要是利用质谱进行分析,将你的蛋白带上标签在哺乳动物细胞中过表达,然后利用药物,诱导SUMO化的发生,然后利用标签抗体去捕获后并纯化,然后利用质谱分析
  18. hxwuchina
    hxwuchina  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:morning,两位专家,我目前在抗体领域工作,我比较关心抗体方面的一些问题。在工作中,我们发现,有些抗体比较容易形成聚体,我们想知道,抗体聚体的形成主要与哪些因素有关?会不会也属于PTM?是否可以预先分析抗体中哪些motif比较容易形成聚体?谢谢
    edwardlichina  : 抗体多聚体的形成大部分是认为和盐浓度以及PH值有关,但也不排除PTM的参与
  19. mew_one
    mew_one  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:您好!我理解是可以将PTM的特定motif抗体作为primary antibody应用于Westernblot,那么我们肯定会得到能和这个抗体作用的很多个相应的该motif的活性蛋白的条带,我们是根据蛋白的分子量去判断每个条带对应的是确切哪一种蛋白么?还是仅仅反应总体水平的变化?
    edwardlichina  : 目前使用motif抗体得到的条带很多,一般也只是初步看不同组之间的带型差异,就是看看有没有在某个分子量范围内的条带是不是出现差别,但是不能用来确定是何种蛋白,我们一般会利用motif抗体去做IAP(免疫亲和纯化),就是让修饰肽段亲和在抗体上被微珠捕获,然后再利用质谱去高通量分析。
  20. zxb597
    zxb597  :@edwardlichina @fangweibin119 提问:最近纠结于核蛋白内参的选择。前期实验发现药物处理后对p-erk有影响,而Histone H3是erk的一个下游靶蛋白,所以是不是不能选择Histone H3作为核内参?

关闭提示