选择模板

更多 发表的帖子

13351

浏览

【求助】山黄鳝是鱼类吗?

回帖:1    收藏:0    投票:0

429

浏览

【求助】湿疹用什么药

回帖:2    收藏:0    投票:0

770

浏览

【求助】质粒酶切图求解

回帖:3    收藏:0    投票:0

更多 最新动态

  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤(二)sgRNA的设计及退火 33天前
    小兔杀手 从实验技术上讲,现在普遍使用的CRISPR工作载体构建采用的是酶切连接方法,绝大多数采用的是BbsI、BsaI等位点,之后采用引物退火配对、连接的方法进行。如果已经建立了可靠的SOP,这个方法的问题不大,如果SOP不完善就会出很多小问题。主要如下:1、BbsI、BsaI内切酶稳定性不足,实际使用中容易导致载体切不完全的问题;2、引物退火效果不理想导致克隆阳性率低;3、连接配比不理想,转化效率低。因此,我强烈推荐基于重组整合方法设计的CRISPR载体,使用难度低,可靠性强,而且成本上也不会增加。其实验步骤分三步:1、使用XbaI、EcoI等其他稳定可靠的内切酶酶切载体,回收载体;2、使用PCR将靶点做到特定片段上,回收片段;3,重组整合反应,转化即可。 这位小哥,就操作上来讲
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 单gRNA和双gRNA的选择 57天前
    反对楼上说法。第一,权威文献单基因突变基本都是单gRNA。除非必须做大片段敲除。第二,cas9突变效率平均在40%以上,一个基因设计3条,单独检测突变效率,选择突变效率最高的是目前最常用的方法。第三,多gRNA表达系统不仅增加了载体构建难度,还提高了载体的大小,不利于转化或者包病毒。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 crispr grna载体构建单酶切问题 57天前
    type IIS 限制性核酸内切酶,一个酶切出两个酶切位点,质粒酶切产物按照酶的说明加热灭活后加入少量的引物退火adapter,补ATP和T4连接酶,后面常规操作。克隆子可以有几百个,95%以上的阳性率,用U6启动子正向引物和gRNA反向引物进行菌落PCR鉴定为最简单的方法,也可以提质粒做Type IIS酶切,连上的是切不开的。那些杂七杂八的方法也能做出来,阳性率和花费的时间都没法跟上述方法比。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 求助cas蛋白和gRNA组装问题 57天前
    核心质粒本质上只动了gRNA表达盒,荧光正常没突变的,基本就是gRNA没设计对或者没连对。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 蔗糖自杀基因筛选双交换子 166天前
    mpark给出了很规范的解释。不过,他在告诉你怎么看你为什么做不出来,而由于你导师确定了让你做这株菌,你知道了为什么做不出来也没什么卵用。一般来讲你的sac B基因及其表达是不会出错的,大概率是你的菌并不是一株sac B十分敏感的菌株。然后你花几个月证明了这一点,证明自己做不出来,你觉得有用吗?
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 蔗糖自杀基因筛选双交换子 172天前
    why not talking sth about E.coli evolution.
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 嘌呤霉素会导致带抗性的阳性细胞大量死亡吗 177天前
    这个药物浓度其实不低。我做到0.1ug/ml的puromycin还有细胞被杀。另外要注意,药敏试验应当铺好细胞,养上一天再加药。而最后筛选浓度只要介于抗性细胞最高耐药浓度和敏感细胞最低杀伤浓度间即可。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 嘌呤霉素会导致带抗性的阳性细胞大量死亡吗 186天前
    请问“不论浓度设置多低”的“多低”到底是多低?如果我给你回答,你用较低浓度的puro就好。你满意不?
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 如何寻找一个基因或蛋白的标准序列 200天前
    非常有用
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 扩基因后胶回收测浓度用与于连接载体,请问各位大佬,为什么测浓度时出现这两种不同曲线,急急急,求解,谢谢啦。 269天前
    真正的大佬会告诉你,DNA Marker说明书上标注最亮条带上样量6ul 其中有DNA100ng。自己加2ul PCR产物如果跟这货差不多亮,那就是50ng/ul左右。能眼见为实的就不要看机器。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 小鼠胚胎干细胞 异常死亡 289天前
    我也在养小鼠胚胎干细胞,你这种情况会不会是传代的时候消化不够,而且细胞用量比较大啊。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 现在有没有同仁在做肠道菌群和炎症性肠病相关实验的? 289天前
    你做肠道菌群结合临床没法做动物实验啊,因为肠道菌群对人免疫系统的调控,这个在小鼠内是没法模拟的,小鼠有自己的肠道菌群和调控关系。除非研究小鼠自己的,那就是基础研究了,跟你临床就没联系了。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 急求助:合成两条互补引物,退火后能直接连酶切的载体吗? 291天前
    welloff 给出了正解。只需一条链连接成即可,另一条在细菌中通过修复可以搞定。另一个是引物退火,避免快速降温,防止茎环结构和其他错配,另外摩尔比例一定要1比1.
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 嘌呤霉素会导致带抗性的阳性细胞大量死亡吗 292天前
    加嘌呤霉素前应该用wild type 细胞做一个药敏试验,可以选取LD50或者最小致死剂量作为筛选浓度。细胞状态好用药就多点,差就少点。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 现在有没有同仁在做肠道菌群和炎症性肠病相关实验的? 292天前
    血清学不太了解,如果能关联肠道菌群和免疫系统应该是不错的结果。粪便里分细菌做宏基因组,流式细胞仪啥的测一下T细胞亚群和一些天然免疫细胞。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  的帖子被加了1分 293天前

    回复:那位做过mini-Tn5随机插入?小弟有个问题想要请教。

    做了两年突变体库毕业的路过。。。。静下心来慢慢做,效率低就多挑几个板子。基本方法就是那些,接合转移后涂平板就行了。如果你做的这个菌种接合转移不好做,就提质粒做电转。这些都不是问题,主要是突变体出来之后有大量的筛选实验,和筛选到阳性克隆后,突变位点的鉴定。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  的帖子被加了1分 293天前

    回复:【求助】现在有没有同仁在做肠道菌群和炎症性肠病相关实验的?

    卢冬雪901126 有没有相关的介绍啊关联肠道菌群和慢性炎症引发的肿瘤,做基因功能没有太大意义。应该是健康人群和病人肠道菌群做宏基因组,比较差异菌群。如果已经选定了某个菌种,那就只能做细菌和细胞的互作了。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 那位做过mini-Tn5随机插入?小弟有个问题想要请教。 294天前
    做了两年突变体库毕业的路过。。。。静下心来慢慢做,效率低就多挑几个板子。基本方法就是那些,接合转移后涂平板就行了。如果你做的这个菌种接合转移不好做,就提质粒做电转。这些都不是问题,主要是突变体出来之后有大量的筛选实验,和筛选到阳性克隆后,突变位点的鉴定。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 现在有没有同仁在做肠道菌群和炎症性肠病相关实验的? 294天前
    关联肠道菌群和慢性炎症引发的肿瘤,做基因功能没有太大意义。应该是健康人群和病人肠道菌群做宏基因组,比较差异菌群。如果已经选定了某个菌种,那就只能做细菌和细胞的互作了。
  • zt滔滔江水
    zt滔滔江水  回复了帖子 目标片段中有重复的部分就扩增不出来了? 349天前
    正解如下:1. PCR优先扩增小片段2. PCR每次的延伸存在不完全的现象3. 扩增产物单链如果末端存在互补序列,可以作为引物进一步延伸。那么,你的问题的解释就是,少量扩增到第一个重复片段的单链,在下一个循环时,结合到第二、第三个重复片段上,作为引物向下延伸,这样延伸出来的产物是含有两个引物的特异性结合序列的,而产物由于比正常延伸的完整片段短,其在后续扩增过程中放大的速度大于正常的完整片段扩增。这个是PCR存在的固有缺陷,除非聚合酶效率高到每次延伸保证完全。而PCR程序中循环过后的72℃ 5min就是告诉你,聚合酶存在延伸不完全的情况。

关于我们|联系我们|版权声明|资格证书|丁香志|加盟丁香园|友情链接 丁香园旗下网站: 丁香园|丁香通| 人才|会议|药学|博客