选择模板

更多 最新动态

  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 买不到做ChIP的抗体如何解决? 135天前
    没有ChIP级别,可以买IP级别的。标签抗体需要你构建过带有标签的过表达载体转染细胞,后用标签抗体做ChIP-IP。
  • xue454962321
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149 336天前
    一个泛素分子量大小是8.5kDa,而蛋白质上可以发生单泛素化修饰,多泛素化修饰,以及多聚泛素化修饰。可以找找有没有软件或者网站可以预测蛋白质上面可能的泛素化修饰位点和个数。
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149 337天前
    第一:IgG在相同位置有条带,有可能是非特异性结合,不同种属抗体进行IP和WB检测来去除抗体重轻链的效果并不是很好的,抗体交联在柱子上面是化学试剂产生的共价键结合,都会不容易被洗脱下来。25kDa的抗体轻链没有信号,说明抗体是没有被洗脱下来的。IgG里面更大可能是非特异性结合。建议可以更换其它厂家的IgG或者增加IP后的漂洗次数和时间。第二:你右边的膜没有标记Mark,泛素化修饰检测出来的条带应该比蛋白质自身抗体条带向上偏移一些。蛋白质自身抗体检测也有可能会是多条带,泛素化修饰和没有修饰的蛋白都会被检测到,而泛素化修饰抗体只能检测出泛素化修饰之后的蛋白。100kDa以上的信号是不是这个蛋白发生的泛素化修饰,这个不好下结论,如果多次实验结果都是这样的,建议切胶去打质谱分析鉴定是什么蛋白质。
  • xue454962321
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 每月蛋白版风云战友奖励专用帖 350天前
    得票第六
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 CHIP中配的液体LiCl洗涤缓冲液为何不溶? 371天前
    建议你还是买sigma的脱氧胆酸钠。我一开始配这个溶液的时候也是浑浊的,调PH值会澄清。但是后面买了Sigma的脱氧胆酸钠。LiCL也可以配成10M母液。
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 求助二代测序数据分析 371天前
    武汉生命之美科技有限公司
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 CHIP中配的液体LiCl洗涤缓冲液为何不溶? 372天前
    你配的LiCL才是250mM, 我们配的500nM的LiCL都是正常的。首先脱氧胆酸钠试剂最好用进口的,Sigma配置成10%母液。LiCL配置成 1M母液。试试先加LiCL,加水扩大体积到50ml左右,再加Tri和其它试剂,最后一步加脱氧胆酸钠。
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 冷冻后样本及新鲜样本IP区别 373天前
    没做过新鲜的样本,做的都是冷冻过的
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 GST标签蛋白结合beads后pp酶酶切纯化 379天前
    酶的说明书上写的酶切温度是室温吗?还有用PBS重悬磁珠加酶酶切可能合适,每个酶反应都有自己的buffer,最好是配置酶切反应需要的buffer去重悬磁珠,再去加酶进行反应。同时也有可能会是蛋白质构像折叠导致酶不能很好识别反应的氨基酸序列。
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149 380天前
    这个条带有可能会是发生泛素化修饰的诱饵蛋白,如果想确定是不是诱饵蛋白,可以SDS-PAGE电泳之后银染切胶去打质谱分析。
  • xue454962321
    xue454962321  的帖子被加了1分 382天前

    回复:IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149

    苏虹是跑的变性SDS,就是做完IP直接加上样缓冲液煮过后跑电泳,没有多余的处理。我不太明白,煮过后几种相互作用的蛋白分开的话,为啥理想结果是在诱饵蛋白分子量附近出现泛素化条带?另外IP A前的input跑蛋白A,跟IP后再跑A,有什么区别吗?CoIP之后检测泛素化目的是什么?Co...
  • xue454962321
    xue454962321  的帖子被加了1分 382天前

    回复:IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149

    苏虹请教各位,我用Thermo26149试剂盒做的IP,没有经验,有几个问题想看看有没有帮忙解答的。谢谢! 1、细胞裂解一步,我是根据说明书提供的细胞数配裂解液加进去的(说明书上裂解液的量比平时做普通WB时用Ripa的量多不少),得到的裂解蛋白浓度都是1~2ug/ul,是不是太低...
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149 384天前
    泛素化修饰是泛素多肽和蛋白质之间通过酶促反应产生了共价键连接,所以不会被SDS和高温这些方式破坏掉;而蛋白-蛋白之间是非共价键方式形成的复合物,很溶液被破坏掉。你的诱饵蛋白在IP前后WB检测是什么结果。
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 轻链特异性的二抗推荐 384天前
    http://dxys.com/acm7t6; 可以试试他们家的
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149 384天前
    CoIP之后检测泛素化目的是什么?CoIP捕获的是诱饵蛋白以及互作蛋白,是来验证诱饵蛋白和那些蛋白在体内是互作关系。而泛素化检测是验证诱饵蛋白自身以及其互作蛋白是否发生了泛素化修饰反应。你用的泛素化抗体是没有特异性的,就是说只要蛋白质上面链接了泛素化多肽,就会被抗体识别,就会在膜上面出现条带,所以结果是多信号条带。而诱饵蛋白或者互作蛋白WB检测,用的是这个蛋白自身特异性抗体,抗体只能识别检测蛋白特有的序列,所以一般WB检测之后是1条带。如果泛素化结果上的条带和蛋白质特异性抗体结果上的条带可以重合或者稍微上移一点,那可以推测这个蛋白可能发生了泛素化修饰。最好是去打质谱或者用这个蛋白特异性泛素化修饰抗体确定。IP前WB检测A是证明细胞体内确实表达了蛋白A,只有体内表达了蛋白A,那IP捕获才有意义
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 IP检测泛素化的上样量和蛋白浓度问题thermo26149 384天前
    你跑的是变性的SDS-PAGE胶吗?IP之后蛋白在胶上面上移是有可能,但是你这上移了100多kDa还是比较奇怪。SDS-PAGE胶电泳的时候,样本加Loading buffer还开水煮沸5-10min,诱饵蛋白和互作蛋白之间的形成的大分子量理论上应该被解开了。你的细胞样品没有做什么交联处理吧?你的图片曝光时间有点长了,不同厂家的抗体说明书上面都会有他们做的图片。范泛素化的抗体相对定量比较估计很难操作,除非你的蛋白条带分的很开,每一条带之间不会糊在一起,这样可以用软件计算灰度值。
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 轻链特异性的二抗推荐 384天前
    那可以试试IP抗体和WB检测的抗体用不同种属,比如IP用的鼠抗,WB用兔抗。
  • xue454962321
    xue454962321  回复了帖子 轻链特异性的二抗推荐 384天前
    http://dxy.me/EjUfY3;可以用这个

关于我们|联系我们|版权声明|资格证书|丁香志|加盟丁香园|友情链接 丁香园旗下网站: 丁香园|丁香通| 人才|会议|药学|博客