登录| 注册

丁香客

选择模板

更多 发表的帖子

325

浏览

更多 最新动态

  • windkiller1984
  • windkiller1984
    windkiller1984  的帖子被加了1分 263天前

    回复:干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结

    dxy_g2brw092 请前辈以及各位大神们指教一下,14KD分子量的蛋白,我把浓缩胶的量增加了,跑到下图的程度就停了转膜,但最终结果蛋白成团装,难区分,背景较高,请问有什么好的建议吗?感激不尽🙏首先看感觉已经跑出条带了,隐约感觉条带上一团一团的还是按泳道分布的。那么不知道你...
  • windkiller1984
    windkiller1984  的帖子被加了1分 263天前

    回复:干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结

    青黛aa 谢谢楼主的经验,学习了不少新知识。楼主把分泌蛋白的WB做得这么漂亮,好了不起。但我有一些问题请教楼主1.转膜。1)膜。楼主用的是PVDF膜还是NC膜?0.22um还是0.45um?           &nbs...
  • windkiller1984
    windkiller1984  的帖子被加了1分 263天前

    干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结

    个人工作多年以后再回来读博的,所以实验技术什么的从头学起,这其中WB走的弯路最多,现在就和大家聊聊我个人的历程,并交流一下自己的经验。这个经验是我跑一个11KD分子量分泌性蛋白得出的,肯定不会适用于所有情况,但是论坛里面受困于小分子量蛋白WB的朋友还是很多,所以聊胜于无,在此分享...
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 299天前
    组多了确实很难跑齐。我个人的实验分组情况,到6个组时候我也跑不齐,所以我的设计一般就是3、4个组。对于有些8组甚至十几个组跑的很齐的大神,我只有致敬了。。。。我也很想请教他们
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 299天前
    有显影就ok了,至于跑不出趋势,可不可以理解为不是你心中所想之趋势?那么也许现实就是确实没有趋势?大家做实验,都是不愿承认95%的情况下没有心中所要趋势,其实才是真实的情况。。。。
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 做western blot敷一抗的时候忘记加tbst了,直接用双蒸水配的蛋白 306天前
    没试过,不过可能问题不大吧。我都是用的抗体稀释液来配的,也没注意抗体稀释液成分和TBST有啥区别
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 PVDF膜是用0.2um与0.45um的 306天前
    可以的,不过没必要换两种膜来用,有点点麻烦嘛。直接都用0.22呗
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 出丁当求一个ABI7300软件或注册码 320天前
    麻烦版主吧这个帖子删了。。。发重了
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 5丁当求一个ABI7300软件或注册码 320天前
    求帮助,哪位有这个软件啊
  • windkiller1984
  • windkiller1984
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 graphpad作图导出后文字大小会改变怎么处理 349天前
    请问楼主你的问题解决了吗?我也同样困惑。graphpad统计图用的10磅字号,然后WB或其他图里面的字也是10磅,但是拼到一张figure后,字号看起来就不一样,如何才能统一呢?难道只有把graphpad不带字保存或把原来的字PS掉,然后拼一起之后再统一PS上统一的字体字号?
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 graphpad作图导出后文字大小会改变怎么处理 349天前
    请问你的问题解决了吗?我也同样困惑。graphpad统计图用的10磅字号,然后WB或其他图里面的字也是10磅,但是拼到一张figure后,字号看起来就不一样,如何才能统一呢?难道只有把graphpad不带字保存或把原来的字PS掉,然后拼一起之后再统一PS上统一的字体字号?
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 373天前
    还有一种情况,针对你的第二根条带。你所看到中段黑漆麻糊的一片黑色,其实什么都不是,nothing,就是什么都没有,你可不要以为那里是蛋白,仅仅没有聚集成条带而已,no,就是nothing。这种情况怎么来理解呢,其实WB作为半定量的手段,蛋白条带和背景之间就是一个你强我弱的对比关系。当蛋白多,条带就黑黑的很浓,然后背景就很白亮;当蛋白少,条带就浅浅的细细的,背景有时候可能就浑浊一些;当然这也和洗膜、抗体浓度等因素相关。不过总归这个条带的黑亮不黑亮与背景的脏不脏是一个对比关系。回到你这个第二根条带,就是因为什么都没有,所以背景的一些杂质、残留二抗之类的就浮现出来了。其实你注意过WB软件的三维图像的话就有感受,当三维图像有突出于背景很高的高峰的时候,条带的背景一般是干净的,当没有什么高峰,一般背景
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 373天前
    你要是用细胞培养液上清液来提取蛋白,那就可以考虑ELISA的手段了。当然你要执意要提取上清液蛋白,我了解的有个冻干的办法,是在冻干机里进行的,我所在实验室有,不过坏掉了。。。。所以我也没试过这个方法。另外你说的提取的分泌型蛋白很轻,上样了自己不会沉下去。。。。这个问题没遇到过啊,loading buffer 加进去和蛋白变性之后,加到孔道里面肯定会下沉啊。另外你说的marker跑下去了,蛋白没跑下去是什么意思?孔道里面的带有溴酚蓝的蛋白液一点都没往下跑啊?那你是不是换个品牌的loading buffer试试?我想不出来是什么问题。。。。
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 373天前
    我的分离胶是12%,也用过15%的。提蛋白就是RIPA
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 373天前
    这个怎么描述呢。。。。打个比方,假如是一个70KD的蛋白,那么除了70的位置有条带,下面还会有一溜拖尾。但是我个人觉得,只要是根据试剂说明书提取的蛋白,并且经过了变性,低温保存,降解还是不容易的。放个3个月依然能跑出来。并且我以前看的基础理论方面的书貌似也说过,分子量越小越容易降解,结构越简单越容易降解,短肽就比大分子蛋白容易降解。
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 373天前
    我开始跑的时候也经常跑出你这样的条带,至于原因我说不上来,但是根据我个人的经验,首先溴酚蓝不影响你最终的条带显影,切胶时候残留的溴酚蓝即使转到膜上,也不会和抗体结合。另外这一条线一样的黑带不是目的条带,也许是一些小分子、蛋白碎片之类的东西,然后和抗体产生了非特异结合罢了。我的经历和经验推测,你要得12KD的蛋白还是在电泳过程中弥散掉了。解决方案:1、增加压缩胶,2、加大上样量 3、减少在分离胶中的电泳时间 4、增加一抗浓度。其他建议给不了你了。。。
  • windkiller1984
    windkiller1984  回复了帖子 干货:小分子量蛋白(11KD)WB实验艰辛历程及经验总结 384天前
    你这个是不是压缩胶太多了啊。。。分离胶太少或者分离时候电压太低了,marker这个样子不行的,还要再跑,起码15、25两个marker指示带之间的距离有个3mm以上,咱能修剪条带敷上去才好啊。另外我觉得18kd的蛋白不至于太难跑

关于我们|联系我们|版权声明|资格证书|丁香志|加盟丁香园|友情链接 丁香园旗下网站: 丁香园|丁香通| 人才|会议|药学|博客