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  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 CHO细胞的单克隆性 3天前
    据我了解,只有一家,有兴趣的话,后台信息联系吧。曾经军科院也能做,后来因为政策改变,军队系统不能外接收费服务。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 53天前
    这方面我确实不了解。等专业的人来回复吧。不过,我个人的理解。有点类似企业招人一样,性格比较适合岗位;良好的教育背景(比如清华北大或者985)会决定起点;再学习能力。宿主CHO就像人,性格合适;载体类似教育背景;下游工艺类似再学习能力。就目前商品化的细胞系,其实都有相应的建议配套载体和protocol。安装指导走下去,一般不会太差,当然,要更好,还需要花时间去优化。单抗是个系统工程,很难拿出单一的某个环节说多多重要,影像多大。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 54天前
    就常规情况来说,目前国内细胞株开发技术,基本上都少于40块板。关于表达量,这个就复杂了,不是简单细胞株开发就能解决的。我个人感觉,细胞株的高表达/高质量单抗更多的在于宿主CHO的选择、载体的构建、下游工艺等等。克隆挑选无非是一个概率,争取合适的概率拿到一个高一点的细胞株。框子里面挑苹果,框子越大,能挑到好苹果的概率就大一点;但要框子里面都是比较好的苹果,就不是克隆筛选能解决的了。您提的问题都比较大,实话说,这几个问题,解决好了,都是一骗不错的文章了。
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了1分 57天前

    回复:基于Imager的细胞株开发的方法学验证

    无语吸 您好,想请教一下沉底验证怎么验证呢?我们实验室的操作是采用自然沉降2-4h,从来没有想过还需要做验证另外,对于您说的Ghost cell 的比率,这个现象的产生的原因是不是1)由于沉降不完全;2)细胞处于挂壁呢?谢谢!嗯嗯。沉降2-4h是比较合理的。但即使这样也需要验证。...
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 基于Imager的细胞株开发的方法学验证 57天前
    可以考虑静置时间缩短一点,不用那么长。离心有几个好处:1. 可以大幅降低细胞粘壁导致无法对焦的情况;2. 去除气泡;3. 缩短静置时间,降低这个时间内CHO细胞分裂的概率。某些CHO(比如CHO-S)在3h左右分裂的比率会达到20%,即会有20%的细胞铺进去的时候是单个,但静置完成在Day0成像的时候,变成了2个。这种情况在我们的VIPs铺板仪下已经得到证实。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 基于Imager的细胞株开发的方法学验证 58天前
    嗯嗯。沉降2-4h是比较合理的。但即使这样也需要验证。ghost cell产生的原因除了您说的两个以外,还一个可能会跟成像仪有关,有些品牌的成像仪采用的是定焦模式,因为板底不会完全平整,也会造成因为对焦位置不对,造成ghost cell,这个比率能达到20%。沉底验证做起来也比较简单,可以在孔内铺上较多的细胞,比如1000个/孔,分不同的时间去成像,比如20min,40min,1h,2h,3h。通常情况下,1h左右99%以上的细胞都会沉底,这样的情况下,可以考虑略微延长沉底时间。即验证1h可沉底,实际操作可再延长1h。我个人建议,可以考虑先静置短时间,再离心,然后再静置短时间。这个过程可以将沉底的时间缩短到1h左右,而且好处也比较多。。。。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 史上最全FDA意见:关于MCB的单克隆源性 68天前
    这个一般还是咨询申报相关人员吧。这个问题比较大。我个人理解:单抗的单克隆源性要求至少有几个因素:1. 给药量比较大;2. CHO系统变异大;3. 药物生命周期长。如果生物类似药也是这个情况,应该要考虑。我有碰到过做细胞因子的,也在陆续上新的实验方法验证细胞株单克隆性(293细胞)。
  • pk1206
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 75天前
    当然可以采用pool来做,空载CHO优化得到的培养基可以作为未来项目细胞的核心成分,实际操作中,不同项目细胞的培养条件可能会有一些差异,但差异一般不会太大(不排除一些特例)。通常情况下,大家都是先得到空载CHO,然后再开始项目,所以从流程上来说,可以先用空载先优化,再随着项目进展,逐步推进优化。直接用pool做也没任何问题。CD CHO或者Forti CHO是实验室做CHO细胞最常规的培养基了,转染用、摇瓶用,当然也可以用于克隆培养。但普遍情况下,还是专门针对克隆培养/静置培养做一些优化比较好。Thermo的CHO-S在CD-CHO的静置培养下,还可以(有些实验室做的这个体系也不一定好),其他的就未必了。我认为克隆培养基优化,不必一定要围绕CD或者Forti来进行。首先:市面上已经有不少商品
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 基于Imager的细胞株开发的方法学验证 85天前
    验证还是老方式,核心包括两部分:沉底验证和方法交叉验证(明场和荧光)。验证层面其实也就那样,也没特别复杂。国内几个客户都陆陆续续做好了。现在有VIPs的孔内液滴照片(whole droplet),未来会直接给出液滴的整孔照片(whole droplet and whole well)。也许,等过段时间,单克隆成像仪都可以不用了,也不需要多个时间点,拍多个照片了。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 基于Imager的细胞株开发的方法学验证 85天前
    有限稀释方式的克隆筛选得到的单克隆细胞,是概率。实际上,有限稀释方法得到的单克隆是没办法证明单克隆的,只能推定为单克隆。到底多少概率可以推定为单克隆呢?一直没有官方的说法,但FDA等法规部门的reviewer在外与研发人员沟通和交流时,认可<0.5 cell/well的两轮克隆筛选(按泊松分布,0.5两轮单克隆理论概率为95%),实际评审时,也是这么执行的。包括单克隆成像仪,都只是提高细胞为单克隆的可能性或者说概率(probability),并辅以影像进行说明。并非严格意义上的证明(Asuurance)。如果说实验手段来证明细胞为单克隆的,法规目前应该至少认可两类数据:1. 单细胞测序,证明不同单个的细胞,在基因水平证明各个细胞一致;2. FISH 荧光原位杂交,在染色体水平证明细胞之间的一
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 107天前
    嗯,同意。不过,您说的这个技术路线,我可以100%的肯定,您至少得做两轮。一轮极有可能被挑战,已有被拒先例。这其实是一个效率速度和价格成本的考量。其实,CSI也可以不用的。直接两轮或者顶多显微镜看看就行。另外一层,我个人的想法,对于单抗来说,其实实验室的设备支出,占项目总支出比率极小(仿药临床动辄8000万,上亿)。对于规模化或者正规企业的研发来说,速度和效率低下才是高昂的成本。当然,通常这些情况,主要都是老板要考量的,呵呵部门带头人要考虑的是:老板说“人家某某公司45天、60天就完成了细胞系构建,你们怎么要6个月、9个月的”该如何回答。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 110天前
    周一早上公司开会,敲到一半,就先回复了。就我们目前碰到的情况,如果宿主系统稳定的话,其实准确点控制扫描间隔时间,是可以避开1变3或者1变4的这种情况。我们通常认为24h拍摄,都是假设了宿主细胞CHO是24h分裂,如果确认了您实验室的宿主系统并不是这样的倍增,完全可以考虑按实际倍增情况去安排扫描间隔时间。只有出现1变3或者1变4的这种情况,具体操作可以参加如上描述。但现在有一种比较先进的铺板系统,比如我们Solentim VIPs,这个仪器可以在细胞进入板的瞬间就完成拍照。VIPs通过纳升(nl)级别的细胞液滴进行铺板,液滴进入微孔板后,立刻对液滴进行拍照,从而在铺板时,即可知道您的项目所铺设的板子里面有多少单克隆孔(通过评估细胞存活的情况,也就可以预估出能有多少单克隆团)。对于细胞株克隆筛选
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了1分 110天前

    回复:IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等

    liangdouxiong 万一拍到的细胞是1变3,1变4能作为证据吗?有时候细胞增殖不是那么规律啊。嗯嗯。同意laorentou的观点。一般来说,我们默认CHO是24h倍增,但考虑到几个情况:1. 实际CHO的倍增可能超过或者低于24h,尤其是CHO-S,倍增时间可能低于20h...
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 110天前
    嗯嗯。同意laorentou的观点。一般来说,我们默认CHO是24h倍增,但考虑到几个情况:1. 实际CHO的倍增可能超过或者低于24h,尤其是CHO-S,倍增时间可能低于20h;2. 接种的细胞可能本身就处于即将分裂的状态,进入孔板后,可能很快就分裂了;3. 细胞状态不好,恢复时间较长,可能前面24h都不进行分裂。如上情况,都可能出现。通常在实验室实际操作过程中,出于严谨考量,这类细胞/单克隆孔归入备选里面去较好。如确实要选择这类孔,需注意进行相关的数据收集。
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了3分 117天前

    回复:CHO细胞的单克隆性

    刚发现置顶了,正好可以把手上正在整理的一点东西再update一下。还是初稿,后续要是修改或者补充了再跟大家汇报。就目前国内总体研发情况来看:1. 大多数企业仍以2轮为主,并辅以Cell Metric单克隆成像(一般是第二轮时用)的克隆流程。好处是单克隆性不会有任何问题,尤其前两年...
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 CHO细胞的单克隆性 117天前
    刚发现置顶了,正好可以把手上正在整理的一点东西再update一下。还是初稿,后续要是修改或者补充了再跟大家汇报。就目前国内总体研发情况来看:1. 大多数企业仍以2轮为主,并辅以Cell Metric单克隆成像(一般是第二轮时用)的克隆流程。好处是单克隆性不会有任何问题,尤其前两年CFDA只认2轮的时候。缺点是费时间。2. 陆续有企业开始彻底转向一轮+Cell Metric。主要两个原因:1. 项目赶时间;2. 已经有比较多的一轮申报成功,风险小很多。需要特别注意的是:由于采用更快速的克隆方式(一轮),单克隆性的确认会完全依赖于单克隆成像仪,所以要注意:1. 成像仪本身性能;2. 务必做好克隆方法的验证。3. 有不少企业在细胞株构建、培养和下游工艺已经做得非常牛了,包括传统单抗走在前面的本土公
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 CHO细胞的单克隆性 117天前
    本贴的附件主要都是本文内容里面的来源。PPT的内容是Rashmi的报告,他应该是目前FDA OPQ的Reviewer Chief。另外的一个附件是OBP的FDA CDER报告,更早一些,2013年的。贾博士的的那个帖子链接,在第八楼园友也贴了,跟我的帖子“IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 - 丁香园论坛”内容是一样的。多谢置顶!有啥随时沟通。。。
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加为精华了 117天前

    CHO细胞的单克隆性

  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了1分 170天前

    回复:细胞株传代稳定性产量影响因素

    rudy668 是否有相应的参考文献分享,这个测定出来如果有影响,可以有相应的办法提高吗?否则只是弄清一个原因也还是没有文献,只是讨论起来,发现了这种情况,目前还没有太多解决办法。分享出来,也许是个寻找问题的新思路和角度。CHO,相较于其他细胞系,它的遗传稳定性不佳一直存在。所以...

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