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  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 史上最全FDA意见:关于MCB的单克隆源性 2天前
    这个一般还是咨询申报相关人员吧。这个问题比较大。我个人理解:单抗的单克隆源性要求至少有几个因素:1. 给药量比较大;2. CHO系统变异大;3. 药物生命周期长。如果生物类似药也是这个情况,应该要考虑。我有碰到过做细胞因子的,也在陆续上新的实验方法验证细胞株单克隆性(293细胞)。
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  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 8天前
    当然可以采用pool来做,空载CHO优化得到的培养基可以作为未来项目细胞的核心成分,实际操作中,不同项目细胞的培养条件可能会有一些差异,但差异一般不会太大(不排除一些特例)。通常情况下,大家都是先得到空载CHO,然后再开始项目,所以从流程上来说,可以先用空载先优化,再随着项目进展,逐步推进优化。直接用pool做也没任何问题。CD CHO或者Forti CHO是实验室做CHO细胞最常规的培养基了,转染用、摇瓶用,当然也可以用于克隆培养。但普遍情况下,还是专门针对克隆培养/静置培养做一些优化比较好。Thermo的CHO-S在CD-CHO的静置培养下,还可以(有些实验室做的这个体系也不一定好),其他的就未必了。我认为克隆培养基优化,不必一定要围绕CD或者Forti来进行。首先:市面上已经有不少商品
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 基于Imager的细胞株开发的方法学验证 19天前
    验证还是老方式,核心包括两部分:沉底验证和方法交叉验证(明场和荧光)。验证层面其实也就那样,也没特别复杂。国内几个客户都陆陆续续做好了。现在有VIPs的孔内液滴照片(whole droplet),未来会直接给出液滴的整孔照片(whole droplet and whole well)。也许,等过段时间,单克隆成像仪都可以不用了,也不需要多个时间点,拍多个照片了。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 基于Imager的细胞株开发的方法学验证 19天前
    有限稀释方式的克隆筛选得到的单克隆细胞,是概率。实际上,有限稀释方法得到的单克隆是没办法证明单克隆的,只能推定为单克隆。到底多少概率可以推定为单克隆呢?一直没有官方的说法,但FDA等法规部门的reviewer在外与研发人员沟通和交流时,认可<0.5 cell/well的两轮克隆筛选(按泊松分布,0.5两轮单克隆理论概率为95%),实际评审时,也是这么执行的。包括单克隆成像仪,都只是提高细胞为单克隆的可能性或者说概率(probability),并辅以影像进行说明。并非严格意义上的证明(Asuurance)。如果说实验手段来证明细胞为单克隆的,法规目前应该至少认可两类数据:1. 单细胞测序,证明不同单个的细胞,在基因水平证明各个细胞一致;2. FISH 荧光原位杂交,在染色体水平证明细胞之间的一
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 41天前
    嗯,同意。不过,您说的这个技术路线,我可以100%的肯定,您至少得做两轮。一轮极有可能被挑战,已有被拒先例。这其实是一个效率速度和价格成本的考量。其实,CSI也可以不用的。直接两轮或者顶多显微镜看看就行。另外一层,我个人的想法,对于单抗来说,其实实验室的设备支出,占项目总支出比率极小(仿药临床动辄8000万,上亿)。对于规模化或者正规企业的研发来说,速度和效率低下才是高昂的成本。当然,通常这些情况,主要都是老板要考量的,呵呵部门带头人要考虑的是:老板说“人家某某公司45天、60天就完成了细胞系构建,你们怎么要6个月、9个月的”该如何回答。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 44天前
    周一早上公司开会,敲到一半,就先回复了。就我们目前碰到的情况,如果宿主系统稳定的话,其实准确点控制扫描间隔时间,是可以避开1变3或者1变4的这种情况。我们通常认为24h拍摄,都是假设了宿主细胞CHO是24h分裂,如果确认了您实验室的宿主系统并不是这样的倍增,完全可以考虑按实际倍增情况去安排扫描间隔时间。只有出现1变3或者1变4的这种情况,具体操作可以参加如上描述。但现在有一种比较先进的铺板系统,比如我们Solentim VIPs,这个仪器可以在细胞进入板的瞬间就完成拍照。VIPs通过纳升(nl)级别的细胞液滴进行铺板,液滴进入微孔板后,立刻对液滴进行拍照,从而在铺板时,即可知道您的项目所铺设的板子里面有多少单克隆孔(通过评估细胞存活的情况,也就可以预估出能有多少单克隆团)。对于细胞株克隆筛选
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了1分 44天前

    回复:IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等

    liangdouxiong 万一拍到的细胞是1变3,1变4能作为证据吗?有时候细胞增殖不是那么规律啊。嗯嗯。同意laorentou的观点。一般来说,我们默认CHO是24h倍增,但考虑到几个情况:1. 实际CHO的倍增可能超过或者低于24h,尤其是CHO-S,倍增时间可能低于20h...
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 44天前
    嗯嗯。同意laorentou的观点。一般来说,我们默认CHO是24h倍增,但考虑到几个情况:1. 实际CHO的倍增可能超过或者低于24h,尤其是CHO-S,倍增时间可能低于20h;2. 接种的细胞可能本身就处于即将分裂的状态,进入孔板后,可能很快就分裂了;3. 细胞状态不好,恢复时间较长,可能前面24h都不进行分裂。如上情况,都可能出现。通常在实验室实际操作过程中,出于严谨考量,这类细胞/单克隆孔归入备选里面去较好。如确实要选择这类孔,需注意进行相关的数据收集。
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了3分 51天前

    回复:CHO细胞的单克隆性

    刚发现置顶了,正好可以把手上正在整理的一点东西再update一下。还是初稿,后续要是修改或者补充了再跟大家汇报。就目前国内总体研发情况来看:1. 大多数企业仍以2轮为主,并辅以Cell Metric单克隆成像(一般是第二轮时用)的克隆流程。好处是单克隆性不会有任何问题,尤其前两年...
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    pk1206  回复了帖子 CHO细胞的单克隆性 51天前
    刚发现置顶了,正好可以把手上正在整理的一点东西再update一下。还是初稿,后续要是修改或者补充了再跟大家汇报。就目前国内总体研发情况来看:1. 大多数企业仍以2轮为主,并辅以Cell Metric单克隆成像(一般是第二轮时用)的克隆流程。好处是单克隆性不会有任何问题,尤其前两年CFDA只认2轮的时候。缺点是费时间。2. 陆续有企业开始彻底转向一轮+Cell Metric。主要两个原因:1. 项目赶时间;2. 已经有比较多的一轮申报成功,风险小很多。需要特别注意的是:由于采用更快速的克隆方式(一轮),单克隆性的确认会完全依赖于单克隆成像仪,所以要注意:1. 成像仪本身性能;2. 务必做好克隆方法的验证。3. 有不少企业在细胞株构建、培养和下游工艺已经做得非常牛了,包括传统单抗走在前面的本土公
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 CHO细胞的单克隆性 51天前
    本贴的附件主要都是本文内容里面的来源。PPT的内容是Rashmi的报告,他应该是目前FDA OPQ的Reviewer Chief。另外的一个附件是OBP的FDA CDER报告,更早一些,2013年的。贾博士的的那个帖子链接,在第八楼园友也贴了,跟我的帖子“IBC会议Audrey Jia 的报告:细胞系开发中涉及细胞株单克隆源性的法规等 - 丁香园论坛”内容是一样的。多谢置顶!有啥随时沟通。。。
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加为精华了 51天前

    CHO细胞的单克隆性

  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了1分 104天前

    回复:细胞株传代稳定性产量影响因素

    rudy668 是否有相应的参考文献分享,这个测定出来如果有影响,可以有相应的办法提高吗?否则只是弄清一个原因也还是没有文献,只是讨论起来,发现了这种情况,目前还没有太多解决办法。分享出来,也许是个寻找问题的新思路和角度。CHO,相较于其他细胞系,它的遗传稳定性不佳一直存在。所以...
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 细胞株传代稳定性产量影响因素 124天前
    没有文献,只是讨论起来,发现了这种情况,目前还没有太多解决办法。分享出来,也许是个寻找问题的新思路和角度。CHO,相较于其他细胞系,它的遗传稳定性不佳一直存在。所以,法规和评审针对CHO的细胞株稳定性要求也会高一些。
  • pk1206
    pk1206  回复了帖子 细胞株传代稳定性产量影响因素 127天前
    是不是可以从染色体水平考察呢??前两天跟客户聊起来关于FISH的。目前在FISH 层面也能做遗传稳定性。并且国外这项业务已经有相当一段时间了。在国内,我的这个客户刚开始,算是做了几个客户项目了。遗传稳定性检测分成了三类:1.基因序列稳定性;2. 拷贝数稳定性;3. 染色体水平稳定性基因序列稳定性就不说了,一般实验室都会去送检的。就实验层面来说,拷贝数的稳定性检测的CV非常大,可能由于QPCR本身的方法学稳定性,也跟CHO有一定的关系。拷贝数稳定性是法规明确要求的起码实验数据,一般实验室自己就能做。这方面大家都比较了解,可能遇到的问题也都清楚。染色体水平的稳定性,这个比较有意思。以前我在帖子里面提到过,CHO细胞本身存在较为严重的遗传稳定性问题,其中重要的一点就是染色体稳定性,CHO的染色体稳
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    pk1206  的帖子被加了1分 210天前

    回复:国内外细胞质基质检测要求(美国、欧洲、中国)

    jackieustc 是的,如果早期没证据,后面项目也不能死了,就需要别的手段证明。细胞库检验上就这个了,另外的就是工艺批间一致性数据支持。@pk1206 你来解释一下?额。。。好吧。总体上来说,还是在建库的时候就买上我们的Cell Metric吧,就不用太担心了。如果没买,或者...
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    pk1206  回复了帖子 国内外细胞质基质检测要求(美国、欧洲、中国) 210天前
    额。。。好吧。总体上来说,还是在建库的时候就买上我们的Cell Metric吧,就不用太担心了。如果没买,或者是之前的项目,还可以FISH再补充验证一下的,也可以找我的。。。。FISH是通过荧光探针检测单个CHO细胞上的各个染色体的整合位点并进行定位。有分单色的和多色探针检测。比如,通过FISH实验,在细胞铺片上随机选取100个细胞,对这100个细胞进行染色分析。如果是单克隆的,那么,这100个中无论哪一个,都具有同样的染色体整合位点,比如都是1号染色体的着丝粒远端和der 3染色体中着丝粒。如果非单克隆的,那么可能会出现两个或者多个不同的整合位点。FISH实验是FDA比较认可的单克隆性支持实验之一。但由于CHO细胞本身随培养,尤其是摇瓶培养染色体变化特别大,这个实验其实并不好做。通常来说,
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    pk1206  回复了帖子 DNA to IND filing in 14 months 226天前
    Research Cell Bank, 也有叫Pre-Master Cell Bank(PCB)。一般是指建立MCB前的候选细胞库。
  • pk1206
    pk1206  的帖子被加了1分 252天前

    回复:单克隆形成

    jackieustc 第一行和第二行是不是有点诡异,不是应该还有孔是空的么?这是统计单克隆比率的,去除了无细胞孔。按泊松分布理论计算:96孔板,0.5浓度有限稀释;会有61%孔无细胞(约59个孔),39%的孔有细胞(约37个孔);在有细胞的这37个孔中,单个细胞孔占30%,超过1...

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