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  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 关于CCK8,小弟有一些疑惑,希望得到大家的帮助,感激不尽1 3小时前
    你的药物可溶吗?如果可溶,完全可以先溶解,再加入到培养基中,另外增加一个溶剂对照就可以了。这与是否使用96孔板直接测试,没有必要相关了;如果不可溶,或微溶,那么,你这样的方式,如果还使用静置培养,那么局部药物浓度过高,周边药物浓度低,会在培养皿中形成药物梯度,影响药效的测定。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 蛋白诱导表达 19小时前
    看起来非常奇怪。现在解决了吗?如果没有,考虑一下表达的宿主菌以及载体是否有什么特殊。比如:对培养基含氧量,培养基含乳糖,葡萄糖有什么特殊敏感指出。另外,锥形瓶和试管用什么封口?培养体积多大?最后收取诱导培养物的OD600分别是多少?看看不同培养体系对菌分裂生长有没有显著差别。
  • IgY_fellow
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 coIP在空白对照组也出现了很强的带,求助 1天前
    是什么方法做的coIP?很明显,不论用的是免疫磁珠还是免疫凝胶,非特异性结合的蛋白都没有成功洗涤除去。因此你的洗涤条件需要优化了
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 WB拖带求救啊! 1天前
    把每一步具体使用的缓冲液组分列出来分析一下,看看其中是否会有组分干扰蛋白电泳。至于电泳凝胶,转膜问题,其实可以简单地用个分子量marker做对照,就可以确认,凝胶,电泳以及转膜过程是否会造成影响。生物学研究,对照很重要。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 western blot中条带遇到条带上奇怪竖线的情况求助 14天前
    楼上的图是转膜后的WB结果吗?从结果看,1. 泳道间有粘联,可能是转膜过程中胶受力不均匀所致2. 单独SDS-PAGE,如果用考染,是否也有“声波状”竖条纹?如果有,可能是核酸杂质。你在蛋白提取时候,加入少量核酸酶,即可解决。3. 是否已排出WB的背景?这种现象,经常见于封闭不佳的情况。所以建议你首先排出WB背景问题。优化封闭条件,封闭液中注意不要出现固体颗粒物。这种情况在用脱脂奶粉时常见。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 关于WB二抗问题 71天前
    你描述的解释,略显牵强。首先需要疑问的是,磷酸化ERK的抗体特异性是否得到了确认?是否可能发生两种抗体混杂污染?以我以前的经验,如果延长电泳时间,提高凝胶浓度,增加磷酸化修饰蛋白与未修饰蛋白的分离度,在同一胶上,是可以观察到两条ERK条带。借此可以有效鉴别出,所示条带为磷酸化,还是非磷酸化ERK。当然如果你有阳性对照物,最为可靠。比如:TPA诱导的细胞提取蛋白。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 细胞技术请教 77天前
    关于黑点成因的说法有很多种,包括:“黑胶虫”。但是解决问题的办法不多,你可以尝试以下方法:1. 尝试血清灭活2. 降低血清使用浓度3. 增加清洗4. 提高培养基更换频率,比如:每天或者每两天更换培养基5. 尝试其他血清
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 WB裂解液 77天前
    准确说,PMSF和PI属于蛋白酶抑制剂,用于防止蛋白质受到酶催化降解;而PPI是磷酸脂酶抑制剂,防止蛋白的磷酸化修饰被磷酸脂酶水解。在检测磷酸化蛋白的实验中,PPI抑制剂就尤为重要。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 小分子与蛋白质相互作用 78天前
    用多功能酶标仪举个例子用蛋白包被酶标板,大概浓度在5-10ug/ml,每孔包被50-100ul. 由此可见包被一块96孔板,大概需要100ug抗原蛋白. 这个包被用量条件是需要事先进行优化确认的。你需要个阳性对照加以确认。如果安排寡糖筛选6个浓度梯度点,2重复,一块板大概可以筛选7个样品。当然如果你的浓度梯度再少一半,可以增加筛选到15个样品。用酶标检测速度快,检测一块板也就1分钟左右。其他服务费用你得和供应商谈,可以先找人要个报价如果接受不了这个成本,液相会是一个比较好的选项。就是通量和速度慢一些
  • null
     关注了 
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  的帖子被加了1分 175天前

    回复:蛋白诱导表达

    小管与大瓶的区别,主要是在于供氧量,以及由此导致的代谢性变化和细菌增殖速度。因此出现不同pattern, 调控情有可原。你目的蛋白的表达控制元件是否收到培养基含氧量,代谢产物调控?类似乳糖操纵子,因而致使目标蛋白表达变化。但是,由于你没有给出其他有关是否真实表达了目的蛋白的辅助证...
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 起始密码子与终止密码子的疑问 212天前
    那就是共用了mRNA, 存在着两种不同翻译体。而不是mRNA剪接体或者不同转录本。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 起始密码子与终止密码子的疑问 217天前
    对HBV不熟悉。我的猜测是,如果病毒可以在细胞内共用这段RNA,有效翻译出三个片段,那么在真核载体上,同样可以表达3种蛋白。病毒后两个蛋白的起始密码子前大概也有类似的翻译前导序列,引导核糖体进行有效翻译,差别仅是翻译效率可能有所不同。当然,如果病毒并不是通过共用RNA,而是通过生成不同mRNA或者mRNA剪接体形式来控制翻译蛋白,那就另当别论。这需要特定的病毒基因转录调控蛋白参与转录控制。单独将这段基因克隆入真核载体,就达不到翻译出三种蛋白的目的。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 怎样用image J进行sholl analysis 呢? 223天前
    collumbus 不是免费软件。是pelkinelmer开发的图像识别软件。一般随机售卖。所以有PerKinElmer的各种细胞分析仪器的实验室,大概会有这款软件。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 求助关于红细胞膜的问题 235天前
    免疫学检测,可以利用红细胞表面标志物来检测, 比如:CD235aTer119
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 免疫荧光定量分析 235天前
    有不少软件都可以。比如:image J等。不过估计,目前最为强大的是 perkinElmer的Columbus。定量都没问题。不过不过是哪种软件,给与软件一个标准参照物,对定量来说都是必须的。至于油镜和放大倍数问题,其实一样,只要给与标准参照图,对软件来说,定量都能做到。至于标记抗体的结果,不知道你标的是什么蛋白,如果本身是弥散在细胞质中的蛋白,会看不到颗粒状。而且即便目标蛋白有特定分布,细胞是立体的,如果不是共聚焦显微镜,你获得的图像本身也是个透过整个细胞叠加呈的像,未必一定能看到颗粒状。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 急!!腺病毒过表达载体 局部注射 大鼠 几天能检测到荧光或基因表达? 235天前
    如果你的启动元件是强启动子,那么一般24-48小时,可以检测到报告基因表达。如果是在转录水平检测,那么24小时应该就能检测到,不同局部可能有所差异。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 蛋白磷酸化组学分析 243天前
    你需要首先有个目标,比如:你关心,关注的具体方向,然后,可以设计进一步的靶点筛选。手段只是个研究的路径,方向才是你目标和核心。和导师讨论一下,具体方向,会让你更快上手。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 蛋白诱导表达 243天前
    小管与大瓶的区别,主要是在于供氧量,以及由此导致的代谢性变化和细菌增殖速度。因此出现不同pattern, 调控情有可原。你目的蛋白的表达控制元件是否收到培养基含氧量,代谢产物调控?类似乳糖操纵子,因而致使目标蛋白表达变化。但是,由于你没有给出其他有关是否真实表达了目的蛋白的辅助证据,建议你先不要先入为主,认定所示条带,即为目标。

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