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  • minlingsmile
    minlingsmile  :【整理总结】Transwell侵袭实验总结 http://dxy.me/JNZFVb
  • minlingsmile
    minlingsmile  回复了帖子 关于FITC-Annexin V/PI细胞凋亡率 784天前
    1、细胞凋亡水平多在晚期,而药物处理时间越长,坏死细胞凋亡数目越多,战友尝试缩短药物处理时间呢?2、细胞圈门有没有问题?FSC-SSC散点图缩小点看,看看细胞团对不对?图中貌似没圈全吧,主细胞团右下角有一部分并不在细胞圈门内呢?3、对照组存在一定比例的坏死细胞,收集细胞时细胞吹打力道过大,胰酶(不含EDTA)消化时间太久都会影响。建议:第一,更换一批细胞试试。第二,细胞收集时力道和消化时间(不含EDTA的胰酶消化时,细胞较平时细胞传代时难以消化,需注意时间)。针对细胞处理的力道,我个人认为虽说的确是影响细胞损伤的一个因素,但以我的经验来说,细胞也并非那么脆弱,正常操作不会导致太多的坏死。除非真的是很粗心的、大大咧咧的人,对待细胞粗暴,才会导致细胞坏死比例多。4、加药处理前,细胞状态如何?细胞
  • minlingsmile
    minlingsmile  回复了帖子 关于FITC-Annexin V/PI细胞凋亡率 791天前
    1、单独从流式凋亡 图上来看,通道1(FL1)的信号不是很强,但是PI染色的荧光强度很强(FL2)。可见Annexin-FITC信号较弱。鉴于战友的Annexin V-FTIC是提前PI染色(15min),因此,建议如下:第一、提高Annexin-FITC染液的终浓度,即增加染料剂量。可做一组Annexin-FITC染液浓度摸索实验。第二、可以尝试控制染色温度在25°C左右。2、从凋亡细胞团来看,对照组细胞存在较多的凋亡细胞和坏死细胞,可能是在收集细胞吹打细胞时力道过大,造成细胞损伤过多。另外,若非操作不当导致对照组凋亡细胞百分比较多,那战友使用的对照组细胞是否本身就存在较高的凋亡水平3、实验组若是药物处理,处理时间也会影响凋亡的早期和晚期细胞百分比。处理时间太久,有可能细胞早已发生
  • minlingsmile
    minlingsmile  回复了帖子 caspase8抑制剂对死亡受体通路的作用? 791天前
    细胞死亡存在细胞凋亡和细胞坏死,细胞凋亡除死亡受体凋亡途径(外源凋亡途径)外,还存在线粒体凋亡途径(内源凋亡途径)以及非经典途径,由EndoG等介导。你的药物处理,检测了死亡受体途径的相关指标,都升高,只能说明,该药物诱导的肿瘤细胞凋亡,存在死亡受体凋亡途径的参与,但这一途径是否是最为核心的凋亡机制,就难以确定了。1、药物处理诱导的细胞凋亡是否同时引起了外源和内源凋亡途径?你使用caspase8的抑制剂,首先,这种抑制剂的效果如何,是否达到了抑制的效果;其次,若caspase8的的确被抑制了,其他凋亡途径如内源凋亡途径的情况如何?是否抑制了外源凋亡途径后,刺激细胞通过内源途径发生凋亡?2、药物诱导是否发生了细胞坏死?你的结果显示,细胞死亡率增加,是细胞凋亡率还是单纯的肉眼观察死细胞漂浮量?3
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    minlingsmile  回复了帖子 流式细胞仪测细胞死亡率问题 883天前
    流式细胞术检测细胞凋亡,最为常见的就是采用Annexin V-FITC/PI双染后上机检测的,可直接购买相关的凋亡检测试剂盒,按照说明书操作进行检测。还有一种是采用PI单染,这种方法一般是用来检测细胞周期,但也可通过subG1期的细胞百分比来判断细胞的凋亡情况。这种情况下就完全按照PI单染检测细胞周期的操作来进行就OK了。
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    minlingsmile  : 我在丁当抽奖抽中了免夜班证,获得5.0个丁当。你也来试试手气吧:http://dxy.me/fUf6Zj
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    minlingsmile  回复了帖子 WB一抗室温孵育多久比较好 1058天前
    我们之前的抗体都是CST或者abcam的,室温孵育,一般都会孵育4个小时左右,(内参除外),孵育后回收4℃保存,很少能用到10次以上,基本上不超过5次,效果逐渐减弱,虽然出带,但效果不好。
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    minlingsmile  回复了帖子 [求助]细胞分泌蛋白怎样提取 1068天前
    刚开始的时候,我朋友是直接测定浓度后跑明胶酶谱的,但是往往浓度很低,胶的条带很弱,后来是买的浓缩柱过柱获得浓缩液后跑的明胶酶谱,效果稍稍好了一点。不过毕竟不是**作的这个实验,所以,有些具体细节我也不太清楚。
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    minlingsmile  回复了帖子 [求助]细胞分泌蛋白怎样提取 1078天前
    之前同一个实验室的朋友也是做分泌蛋白,她的实验操作是先使用正常培养基培养细胞,培养细胞到80%~90%左右时换掉培养液,使用无血清的培养基培养一段时间,然后收集上清培养液,检测蛋白的。跑过明胶酶谱图,也用来做过ELISA。
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    minlingsmile  回复了帖子 悬浮细胞诱导前不贴壁怎么办 1078天前
    最近也看到关于肿瘤干细胞的文献,肿瘤干细胞的确是悬浮的,分化后细胞逐渐开始贴壁。所以楼主培养的未分化的干细胞不贴壁很正常呀,没贴壁有可能是干细胞没有分化呢。建议楼主加入诱导分化培养基后培养一段时间,看看细胞是否分化,分化的细胞是否贴壁。另外,也可以尝试使用一些诱导分化的药物处理,作为阳性对照。
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    minlingsmile  回复了帖子 如果我想让某个蛋白高表达,文献中所说转染某蛋白的cDNA,这个cDNA是怎么设计的?或者怎么可以购买到? 1078天前
    想让某个蛋白高表达,通常是需要构建过表达载体,可以选择普通的质粒表达载体,也可以选择病毒载体。但不论是哪一种,都需要将目的蛋白的cDNA连接到载体上。cDNA是与RNA链互补的单链DNA,是通过以目的蛋白mRNA为模板,在适当引物的存在下,由RNA与DNA进行一定条件下合成的。具体蛋白的cDNA的序列时确定的,一般都可以在NCBI里面查到。主要是需要设计cDNA的引物。这个引物需要扩增出目的蛋白的cDNA,同时也需要包含表达载体的酶切位点等等。简要操作流程:首先提出样本的总RNA,然后逆转录扩增出cDNA;然后设计目的蛋白的引物,以cDNA为模板,扩增出目的蛋白的编码cDNA序列;然后通过酶切连接到T载体或者其他载体,测序验证序列正确性,最终连接到表达载体质粒上,进行后续的筛选,验证表达载体
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    minlingsmile  回复了帖子 细胞传代和复苏方法 1080天前
    细胞复苏:(液氮保存)1、取液氮保存的细胞冻存管快速置于37恒温水中;2、取新鲜培养基DMEM 3mL置于15mL离心管中,再将冻存管中细胞悬液取出,置于含有DMEM的离心管中,1000rpm,5min。3、去掉上清,使用新鲜的DMEM培养基重悬细胞沉淀,置于培养皿中,补足培养基,放入培养箱中培养。优点:离心前加入新鲜培养基,可适当稀释冻存液中的DMSO含量。细胞传代(贴壁细胞):1、从培养箱中取出细胞融合度达到90%~100%的细胞培养皿,吸去上清培养液;2、使用37℃预热的PBS(1x)2mL清洗细胞2次(轻轻加入或液体沿皿壁加入,避免液体将皿底细胞冲下来),吸去清洗液;3、加入适量含有EDTA的胰酶溶液(胰酶浓度0.1%或者0.25%,PBS配制),混匀,使其均匀覆盖皿底。置于培养箱中
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    minlingsmile  回复了帖子 用流式检测凋亡(annexinV-FITC/PI)死细胞过多,凋亡太少,请教各位大神 1080天前
    1、使用不含EDTA的胰酶消化细胞,第一需要控制消化时间不宜太长(具体时间依据具体细胞和胰酶浓度而定),消化时间过长,对细胞的损伤较大;第二,会存在部分细胞消化不下来,在吹打细胞时控制力道,不能太用力,避免对细胞造成机械损伤,也会出现在Q1象限。2、你的Annexin V单染管阳性率为0.4%,可以认为你的Annexin V没有染上。若Annexin V没染上,那凋亡晚期的细胞就出现在Q1象限了。可调整Annexin V染色浓度和时间。3、PI染色通常比较容易染色,你的染色时间为半小时(不知道你的浓度是多少),通常PI染色15min左右就够了。PI具有细胞毒性,时间太长,也易造成假阳性。凋亡检测最好在染色结束后尽快检测完。4、流式细胞圈细胞团的问题,看你的FSC-SSC图,放大倍数较大,左下
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    minlingsmile  回复了帖子 primerbank 1153天前
    不需要登录就可以使用啊http://dxy.me/AZ7Jby
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    minlingsmile  回复了帖子 怎么理解IP图 1153天前
    第一,图中anti-Ub条带是处于弥散的状态,与sh-ctrl比较,表示在泛素化的过程中,linRNA-P21干扰后增加了HIF-1alpha的泛素化。n表示HIF-1alpha降解时HIF-1alpha蛋白连接了1到多个Ub。第二,加入抗体HIF-1alpha的4条带,表示IP的效果很好,IP抗体为HIF-1alpha的出带,而IgG组未出带。此处的IB-anti-HIF 1alpha的结果算是一种对照(IgG组作为阴性对照,IP-HIF-1alpha组作为阳性对照)。
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    minlingsmile  回复了帖子 cDNA储存问题 1190天前
    做荧光定量PCR不是使用的专用封口膜封口吗?那种塑料膜不会影响离心啊。还有,其他人的结果是不是也是差异很大呢?如果是仪器不稳定,那就需要找工程师调试了
  • minlingsmile
    minlingsmile  回复了帖子 关于SiRNA处理后 什么时候加化疗药物对肿瘤细胞处理呢 1193天前
    猜想应该不会,毕竟siRNA干扰时间可达到72h。另外,你需要设置不加药处理的siRNA对照组对比观察。你的实验是想观察这个目的基因会不会参与药物作用,如果基因牵涉其中,那么,在基因敲低的情况下,药物处理,理论上细胞的相关表型是会有所改变的。当然,这需要实验的验证。
  • minlingsmile
    minlingsmile  回复了帖子 关于SiRNA处理后 什么时候加化疗药物对肿瘤细胞处理呢 1193天前
    一般来说siRNA的干扰时间在24~72h,我之前做siRNA时是设置了时间梯度,分别检测了24h、48h和72h三个时间段的干扰效率(RT-PCR和WB检测方法),最后才选择的48h的干扰时间进行加药处理。但是不同目的片段的siRNA可能存在差异,说明书上也是建议设置梯度摸索最合适的干扰作用时间。你要研究目的基因是否牵涉药物作用,应该是干扰掉目的基因后,检测药物对肿瘤细胞的影响(最终的生物学表型和相关蛋白等的改变情况)。既然你的前期发现48h时已成功干扰掉目的基因,建议48h后加药处理
  • minlingsmile
    minlingsmile  : 我参与了@丁香园 发起的投票【丁香园定制帆布包,你最喜欢哪一款?】,我投给了"F 款"这1个选项。你也快来表态吧:http://dxy.me/NrYnUf
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