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【求助】SDS-PAGE上样缓冲液配方?

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【求助】ECL正确的方法及问题原因

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【原创】电泳槽漏液及制胶时漏胶问题

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  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 IRES-EGFP中IRES有启动子的功能么? 38天前
    是不是因为mRNA上的核糖体复合物更容易结合到IRES上,而游离的核糖体酶那么容易识别结合?
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子  请教:IRES2后插入序列问题 38天前
    IRES的作用: 是前面的启动子启动转录出mRNA,核糖体结合上去,找到kozak序列后开始翻译;IRES就是核糖体识别结合mRNA的序列或说特殊结构,核糖体然后往下运行,以后就和前面普通翻译一样,遇到kozak序列开始启动翻译。 好多人搞不清启动子啥作用。启动子是启动转录,不是启动翻译。而IRES,粗略的说是在启动翻译阶段。
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子  请教:IRES2后插入序列问题 38天前
    老问题,我还是再说一下 IRES,不是启动子。它是在mRNA水平上/之后起作用的。 前面要有启动子和目的基因,加IRES,后面再加第二个基因。 如果IRES后面加启动子了,那么,你这个IRES就可以去掉了,它就没有任何意义,就是一累赘。 另外,它后面要加Kozak序列。重要的是后面阅读框肯定要考虑,kozak的ATG之后正确读码。
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 重叠PCR奇怪的现象 49天前
    我前段时间也做了三个重叠PCR,也很奇怪。 第一个是200bp和一个1200bp的,出来一个中等强度的目的条带以及其他大小杂带,回收后或不回收的产物再做PCR扩增,结果就是扩不出来。但是那个中等强度的目的条带确实是对的, 后来直接拿来重组克隆转化,挑出的克隆都是对 的。 第二个,三个片段1800bp,1100bp和700bp重叠,做了好几次,都是3700bp目的条带位置弱弱的带子,然后各种小的带子亮的弱的都有。也是回收或者直接再扩,也是扩不出来。疑似目的带量太少,重组得不到克隆。 第三个是1100bp和1800bp重叠,第一次我没回收直接重叠PCR,倒是很亮的条带且很特异。但是再重复做就不成功,而且也是拿这个回收的目的条带去再扩增,也是扩不出来。 而且,以上都是重复好多次的,都是很难成功或者
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 大片段载体构建 52天前
    实在需要的话,拿来有偿帮助连接构建。
  • liupeng0215
    liupeng0215  发布了新帖 抗体药物筛选方法求助 523天前

    想筛激活型抗体:但是有疑问像CD3激活抗体,一个单价的抗体(单链抗体)即可激活CD3,该抗体需要识别特殊的表位。像OX40,Fas这类蛋白,有天然激活配体。OX40L配体通过三聚体促使OX40等受体三聚化,进而激活下游信号。那么,我想问,如果要筛选OX40这类受体的激活抗体,是需要筛选那种识别特殊表位的(单链抗体就可以激活)的抗体,还是没有表位要求(只要可以和它结合的任意抗体)的任意抗体只要通过三聚化就可以激活,还是两者必须同时满足(既对表位有要求有对三聚化有要求)??

  • liupeng0215
    liupeng0215  发布了新帖 关于激活抗体筛选问题求助 523天前

    像CD3激活抗体,一个单价的抗体(单链抗体)即可激活CD3,该抗体需要识别特殊的表位。像OX40,Fas这类蛋白,有天然激活配体。OX40L配体通过三聚体促使OX40等受体三聚化,进而激活下游信号。那么,我想问,如果要筛选OX40这类受体的激活抗体,是需要筛选那种识别特殊表位的(单链抗体就可以激活)的抗体,还是没有表位要求(只要可以和它结合的任意抗体)的任意抗体只要通过三聚化就可以激活,还是两者必须同时满足(既对表位有要求有对三聚化有要求)??

  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 慢病毒载体:双启动子,内含子可表达miRNA, miRNA 的结合位点也在同一个载体上 564天前
    我也在考虑相关问题。难度时中间的pA问题,导致包装的RNA截短,没有完整的5LTR和3LTR,包装不了了?
  • liupeng0215
    liupeng0215  发布了新帖 请问激活型抗体的结合位点以及筛选方法 605天前

    请问激活型抗体的结合位点以及筛选验证方法这个结合位点,是和天然存在的激活配体重叠,还是说其他位点都可能激活结合?像OX40/OX40L,结合时会形成6聚体,那么它的激活是靠OX40聚集致使胞内段改变还是靠OX40L使其胞内段构型改变而激活?筛选到可以和靶蛋白结合的N多抗体后,如何从中筛选出具有激活功能的?或者如何直接筛选出?

  • liupeng0215
    liupeng0215  发布了新帖 请问激活型抗体的结合位点以及筛选验证方法 605天前

    请问激活型抗体的结合位点以及筛选验证方法这个结合位点,是和天然存在的激活配体重叠,还是说其他位点都可能激活结合?像OX40/OX40L,结合时会形成6聚体,那么它的激活是靠OX40聚集致使胞内段改变还是靠OX40L使其胞内段构型改变而激活?筛选到可以和靶蛋白结合的N多抗体后,如何从中筛选出具有激活功能的?或者如何直接筛选出?

  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 2-巯基乙醇配制培养基,是否需要过滤除菌? 658天前
    应该不需要过滤。强还原剂,应该不会有什么能够存活的。怎么配?直接加到培养基里呗。浓度嘛,你查下你养的细胞的培养基配方
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 MCF-7细胞长出很多伪足,以前没怎么多明显,怎么解决,**大神指点!! 730天前
    感觉这个细胞就不像ATCC上面的MCF7。楼上有说培养试剂没问题?怎么得出了的结论?我觉得是消化过度或者培养体系营养方面的问题,比如血清质量靠谱吗?是不是换了一批,培养基是不是过期了?
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 文库中高GC含量片段,PCR后特异性差 730天前
    没你那么高你预变性温度高些时间长些。退火还可以再升高试试
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 间接ELISA法测定亲和力的问题 833天前
    以为是年久的老帖子呢。同意楼上的,就是包被抗原不够呗,反应饱和了上不去。但是,貌似楼主说,一样的实验,别人做的B浓度也可以上到2,楼主的却做不到?确定实验做法一样、显色时间一样、两个人的稀释浓度正确吗?
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 科研用吉西他滨溶解与保存 833天前
    -80度,DMSO至少半年吧
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 科研用吉西他滨溶解与保存 834天前
    稳定性    3年 -20℃粉状    6个月-80℃溶于溶剂    别名    LY-188011, NSC 613327    溶解性 (25°C) *    体外    DMSO    15 mg/mL (56.99 mM)    水    <1 mg/mL (<1 mM)    乙醇    <1 mg/mL (<1 mM)    
  • liupeng0215
    liupeng0215  的帖子被加了1分 854天前

    回复:【求助】SH-SY5Y形态求助

    细胞形态改变,也可能是培养基不同导致吧。我的经验:1,BxPC3细胞,高密度传代和低密度传代,形态会不同。2,SK-MEL-28细胞,DMEM(高糖)和MEM培养,形态不同。但更换彼此培养基后,形态会恢复到该培养基的细胞形态。我之前有一瓶该细胞,用MEM养的,大体梭形兼两头少量触...
  • liupeng0215
    liupeng0215  回复了帖子 mrc-5细胞培养问题 879天前
    很好养。
  • liupeng0215
    liupeng0215  发布了新帖 抗体体外筛选系统的一些疑问 938天前

    请问,抗体库、蛋白库,体外筛选抗体,如何保证特异性(不与非靶蛋白结合)?验证时使用同家族蛋白还是说相似性蛋白?如何有效查找同家族蛋白?而且有时候同家族的蛋白一级序列似乎相差蛮大的。如何选择相似性高的蛋白?相似性多高算高?仅仅blast比较一级序列相似性是否可以?

  • liupeng0215
    liupeng0215  发布了新帖 关于抗体库体外筛选抗体 938天前

    请问,抗体库体外筛选抗体,如何保证特异性?验证时使用同家族蛋白还是说相似性蛋白?如何有效查找同家族蛋白?而且有时候同家族的蛋白一级序列似乎相差蛮大的。如何选择相似性高的蛋白?相似性多高算高?仅仅blast比较一级序列相似性是否可以?

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