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【求助】PCR阳性,测序为空载,为嘛嘞?

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【求助】请问哪位神仙有IRES和2A序列的EGFP质粒?求。。

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  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 重组质粒构建 10小时前
    当然可以~~
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 我有N套慢病毒系统,谁知道哪个效率高? 另附包lenti的protocol和心得体会。 2天前
    1.这个问题太宽泛啦。。如果你对病毒载体有兴趣,可以私信我你的q。2.慢病毒载体最大的特点就是,有一对LTR,并且有HIV-psy(包装信号),以上两个是必须的,并且普通过表达载体一般没有,所以这两个最容易判断。此外,很多慢病毒载体还会有cPPT和WPRE原件,这些是起增加滴度的辅助作用元件,不是必须与原件。另外,很多同学以为病毒载体很危险,这是缺乏理解造成哒。。病毒载体只有与辅助质粒一起转染特定的包装细胞,才会产生病毒。病毒载体单独转染,基本上与普通载体无异。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 如何选择质粒载体? 6天前
    1. 巨大的载体(30k+)不是特别适合直接转染,效率会有些低,提质粒的要求也比较高2. pUC载体还是算了吧,根本不能表达。。因为木有启动子啊,除非自己再把启动子克隆进去。3. 慢病毒载体可以的,稍微大一点。但是记得转化的时候需要Stbl3或者NEB Stable这类的重组酶缺失的菌株。4. 我倒是有5k以内的表达载体,你可以站短我。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 构建某种基因CRISPR/Cas9敲除质粒 9天前
    人的话,这个Crispr的载体我可以设计和构建。站短我你的q好了。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 稳定干涉后稳定过表达突变体怎么做 9天前
    一个用shRNA的载体,针对你的目的蛋白设计sh序列插入载体,可以考虑做成病毒稳转你的目的细胞;另一个用过表达的载体,过表达你的蛋白的时候,把sh对应的序列同义突变掉,这样sh就不起作用了,相当于你做了rescue。这类的载体我有,可以站短我。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 构建某种基因CRISPR/Cas9敲除质粒 10天前
    你要敲除的是什么物种?哺乳动物?植物?还是其他的菌类的神马。。。站短我你的联系方式。。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 哪位同学有pMIR-Reporter和pmirGLO的空载啊,求助 10天前
    miR-reporter也有。。。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 哪位同学有pMIR-Reporter和pmirGLO的空载啊,求助 10天前
    pmirGLO有,测序过。站短我你的q
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 多套逆转录病毒系统对比 25天前
    常用比例,很多报道。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 比较几套慢病毒系统出毒及感染能力 32天前
    都可以啊,VSVG糖蛋白的慢病毒式都可以感染的。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 rescue experiment of siRNA 33天前
    一般做sh或者si的话,要求比较高的杂志可能会要求补充rescue实验,大体上是这样的:1. 找出siRNA对应的基因的cds2. clone该cds3. 对该si/sh对应的cds部分进行silence mutation,克隆到过表达载体里(可以是普通的载体,也可以是病毒载体)4.如果是普通质粒载体的话,就直接转染你的细胞;如果是病毒质粒的话,可以A.直接转染你的细胞(与普通治理无异)or B包装成病毒用于感染你的细胞。选A还是B要看你实验目的和转染效率。个人认为做成病毒质粒比较好,这样无论单独转染还是后期做成病毒都ok。有神马问题站短我你q。
  • kangaroo0513
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 自噬,GFP-LC3腺病毒 41天前
    一般没问题。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 怎样提高慢病毒包装效率 44天前
    我的经验是,转染只是一个方面,一般转染效率大于50%以上效果不会差的非常多,当然你能让转染效率提高更好,只是我比较看中性价比。然后,关键是出毒效率,我曾经对比过四*青和Hyclone北美的血清,出毒效果差距大概在2个数量级(几十到百倍)。也就是说,转染后的培养条件、细胞状态更为重要。一般我用六孔板转总共4-6ug质粒,每个孔1.5-2ml培养基,48h收毒,空载的原液的病毒滴度一般在10的6-7之间,有插入片段的会稍微低一点,插入片段越大滴度越低。另外,由于我是感染培养的是体外培养的细胞,所以可以用试剂浓缩,浓缩效果很棒。私信我q可以把我用的试剂PDF丢给你供参考。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 哪个公司卖质粒载体靠谱啊 45天前
    CMV-3HA-mcsCMV-MCS-3Flag这两个载体有
  • kangaroo0513
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 Stbl3菌落PCR 56天前
    当然可以,关键看酶牛不牛。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 TUG1质粒构建 59天前
    7.6k的lnc?载体是什么?要不要丢给我连?
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 关于shRNAloop环的问题 60天前
    私觉得无所谓。
  • kangaroo0513
    kangaroo0513  回复了帖子 关于shRNAloop环的问题 60天前
    反义链的loop环....到底是反义链有个碱基错了,还是loop上错了??loop上错了一般无所谓,反义链错了是致命的。

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