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【求助】自噬研究方法

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  • gelinna
    gelinna  的帖子被加了2分 568天前

    LncRNA与miRNA结合位点的预测方法

    LncRNA与miRNA结合位点的预测方法       最近发现不少战友在研究LncRNA与miRNA结合,个人在这里和大家做一下分享。       首先,要找到线索,不能为了趁热点胡编乱造,故事的精...
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 siRNA rescue实验一般突变几个碱基? 1051天前
    足够了,3个点不少了,siRNA的保守性很强的,你这3个点都在序列中间,足够了
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 20叮当币求助关于siRNA的相关问题,siRNA一定是瞬转吗 1051天前
    可以隔几天加一次的,但是要求转染试剂毒性要低,传统的转染试剂毒性高,如果你重复转染对实验的影响非常大,你可以试试Transheep的Namipo,几乎无毒,多加几次不会影响细胞活性的
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 SiRNA和lipo3000瞬转 1051天前
    实验不稳定可能是你每次的操作误差比较大,建议转染的过程不要太复杂,用转染简单高效的转染试剂 ,如life的 RNAimax和Transheep的Namipo,lipo3000可以转染siRNA和质粒,但是没有RNAimax效果好,这个比较一下就知道了,RNAimax的成分中有新型的纳米材料,不完全是脂质体,这个和Namipo有点类似,转染小核酸要明显由于脂质体的,还有你的做阳性对照,比如加一个GAPDH的阳性对照,或者做一个FAM的荧光,这样即使效率不高,也很容易分析出原因。siRNA国内合成就行,siRNA容易降解,国内的公司一般都是现合成的,不比进口的差。
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 N2a细胞转染siRNA 1051天前
    楼主是不是你想要的效果 Transheep的 Namipo 你可以试试
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 siRNA转染整理总结 1051天前
    我给大家推荐一款转染siRNA的新型材料的转染试剂,Transheep的Namipo,效果绝对不比RNAimax差的,贴点图给大家欣赏Transheep的Namipo转染siRNA到VB2Transheep的Namipo转染siRNA到H1299Transheep的Namipo转染siRNA到RAW264.7Transheep的Namipo转染siRNA到A549
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 siRNA转染H1299细胞,NC-FAM转染后未转进去,哪里出了问题? 1051天前
    lipo3000转染的siRNA-FAM到H1299Transheep的Namipo转染的siRNA-FAM到H1299我做的H1299转染siRNA-FAM,siRNA 进入细胞是点状的分布的Transheep的Namipo转染效果稍微好一点,主要是毒性低,细胞活性好很多,但是都不错了,这个细胞转染siRNA还可以的,如果和293比的话还是有差距的。
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 siRNA转染 1051天前
    楼上说计数的时候不用计算死亡细胞,这个是对的,但是不可以忽略死亡细胞对干扰实验的影响,lipo2000已经存在20几年了,现在很多的转染试剂早就超越他了,只是大家习惯于用这个,2000的毒性还是很大的,这个是脂质体的通病。我用的是Transheep的Namipo转染的siRNA,分享你下图片,siRNA转染A549和293T,293已经亮瞎了
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 质粒转染不进去但siRNA出现明显敲低 1051天前
    我来帮你分析一下原因,A549表现出来的不能高表达有两个可能一个是A549属于比较难转的肿瘤细胞一类,不是所有的细胞系质粒都能转的很好,慢病毒转染A549也不是百分之百,需要后续筛选的还有一个可能是本底高,表达时候检测不明显,你提到的siRNA可以干扰,这个和质粒转染是没有关系的,不是siRNA能够转染好,质粒就行,你可以做一个带荧光的质粒试试,看看效率怎么样,A549不是转染不进去质粒,是效率不高,贴个图给你看看
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 如何设计siRNA的rescue实验呢 1051天前
    rescue实验我也来说一下,一般做rescue比较多的是稳转再瞬转,比如构建一个稳转的干扰细胞系,在用质粒或者病毒去做rescue,如果都是用瞬转,siRNA和质粒同时转染吗,一起转也不叫rescue了,siRNA的作用时效短,不可能提前干扰好的,发出来的文章恐怕可信度不高,这样实验影响因素太多了,说不清楚问题。所以我建议做shRNA稳转细胞系,在做瞬转的质粒去rescue,这样发出来的稳转和版主说的不在同一个水平上。rescue实验质粒的构建很简单,siRNA的靶点一般是19nt,6个氨基酸,间隔突变其中的2-3个氨基酸的,同意突变一般都是氨基酸的第3个碱基,siRNA的特异性很强,在target中间位置突变掉2个碱基,就完全不会再结合了。给大家一个建议,shRNA的病毒质粒可以找公司买
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 siRNA和shRNA区别 1051天前
    简单点说,稳转用shRNA病毒,瞬时实验用siRNA。如果你构建shRNA质粒做瞬转,就有点画蛇添足了,siRNA合成现在很便宜,300多一条,构建一个质粒成本远远高于这个,还有干扰一般做一个没有保障,多做几个费用更高,现在的siRNA专用转染试剂可以把siRNA高效转染细胞的,包括大部分原代细胞,比如Life的RNAimax ,Transheep的 Namipo,都可以的,而且毒性低,可以反向转染,多加几次也能延长左右时间。如果你要构建细胞系,那必须用shRNA慢病毒,human和mus的一般公司都有现货的克隆的,比自己构建省事省钱,sigma和Transheep都有这样的文库,几乎所有的基因都能查到的,一个基因可以提供几个克隆的,干嘛自己辛苦去构建,拿回来自己包装病毒就行
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 SiRNA干扰后多长时间检测调控蛋白的变化 1051天前
    对的,不过这种时间不好琢磨,不一定是猜想的那样的,建议多做几个组分,48h、72h、96h分别做检测,做这类实验不要忽略转染对细胞照成的影响,一定要设计好对照组,一般情况下转染试剂对细胞的毒性还是很大的,就是si不起效果,也能引起凋亡。不要让转染试剂的毒性照成了实验的假像。我怕做这个用的是 Transheep的 Namipo转染试剂,毒性可以几乎忽略不计。上面的是3000转的,相比之下细胞活性更好,细胞更亮一点
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 怎么找已知的差异基因哪些位点合成miRNA 1108天前
    你这个话说的不是很明白 ,是预测和mRNA结合的mirna,还是这个基因可形成的mir
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 LncRNA与miRNA结合位点的预测方法 1151天前
    补充一下,lnc和mir的机制验证,可以分别进行过表达和干扰实验,特别提醒的是lncrna是基因全长,克隆的时候要考虑polya的影响,没有polya 的情况下RNA的转录不会终止,这样表达出来的lnc会比野生的长很多,表达的时候要用ploya的载体,有些lnc自己有ploya的,这个也要提醒一下大家,有poly的存在如果要包装慢病毒,会受到很大的影响,因为慢病毒是RNA病毒,转录中止了会无法包装的。如果不清楚,可以咨询Transheep。
  • gelinna
    gelinna  发布了新帖 LncRNA与miRNA结合位点的预测方法 1151天前

    LncRNA与miRNA结合位点的预测方法       最近发现不少战友在研究LncRNA与miRNA结合,个人在这里和大家做一下分享。       首先,要找到线索,不能为了趁热点胡编乱造,故事的精彩如否,开头是非常重要的,万一弄错的方向,再回首只能泪眼朦胧了。具体的方法可以依靠生物信息学进行分析,在这个NGS泛滥的年代,只要你花钱,数据肯定是有的,如果没钱做这些,也可以去找一下别人用剩下的数据,或者在数据库下载,自己不会分析,也可以找专业人士帮你做差异和关联性分析,当然还是要花钱,哈哈。     分析过后的数据,从中选择有价值的部分,进行验证,用自己的样本进行验证,这样才能理论结

  • gelinna
    gelinna  发布了新帖 NgAgo-gDNA-借韩大师的牛刀,屌丝们能不能玩出点花样! 1514天前

         《Nature Biotechnology》上发表了NgAgo——一种全新的基因编辑技术,比CRISPR-Cas9更胜一筹。通读了一下论文,好吧,比CRISPR-Cas9精准度提高一千多倍,由DNA介导,请收下全人类生化同行的膝盖。       韩老师的故事告诉大家,只要肯努力,屌丝也能有春天,虽然道路艰辛一点,但是结果缺失逆天的!大牛可以发表文章,但是很难震惊世界。搞科研就像是修仙小说一样,不管是大牛还是屌丝,必须要突破界限,才能羽化成仙,目的不就是为了捅破那一层薄薄的膜,韩老师就是活生生的例子,这样的剧本才振奋人心嘛。谁都无法预料下一次上帝会握住谁的手划下惊鸿一瞥,很可能就是你,只要你给上帝抓住你手的机会&n

  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 载体及基因资源 1764天前
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  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 贡献您的质粒与菌株,构建【丁香园质粒库】 1764天前
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  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 siRNA转染讨论 1892天前
    siRNA实验具有一定的风险性,所以一次最好多设计几条,一般3-4条左右,我们实验室一直是找Transheep 合成的,质量好,价格优惠,合成套装即便没有效果还可以免费再设计合成,绝对的保障! 另外siRNA转染推荐用 Life的RNAimax ,这个是公认的转染siRNA效果最...
  • gelinna
    gelinna  回复了帖子 siRNA转染讨论 1892天前
    siRNA 转染(权阳生物) A.siRNA转染的方法 脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几点哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染...

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