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  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  的帖子被加了1分 4天前

    回复:分享小鼠BMDM培养心得(个人经验,欢迎指正和讨论)

    细胞因子浓度太低了你,红细胞得裂解。这个牌子的加到一百才有点感觉。消化用EDTA。胰酶用过,中间换了好几次新鲜胰酶,消化了20分钟,吹下来的。
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 BMDM消化的问题 55天前
    10ng/ml
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  的帖子被加了1分 67天前

    回复:BMDM消化的问题

    我那时候没经验,EDTA没消化下来,就改用了冷泉港实验室的一个protocol,里面是用胰蛋白酶消化,按照protocol,先消化几分钟,换新鲜的胰酶,过几分钟,再换新鲜的胰酶,过二十多分钟直接用胰酶吹下来的,有一盘就还可以细胞能用,但是又一盘就完全不行,细胞彻底变圆了,因为我是...
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 BMDM消化的问题 68天前
    得到后面才会分化成巨噬细胞的形态啊
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 2215细胞:贴壁3~4天的细胞图片 173天前
    我的2215怎么是圆圆的感觉,就刚贴壁还有点扁平,以后就是聚团生长了
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 血清灭活的时间问题 178天前
    一般都灭活60分钟,不过要是 有钱还是直接买厂家灭活过的,自己灭活沉淀太多了,还得不时摇匀,麻烦啊
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 为什么培养液一放入培养箱就变成紫色(没放之前是红色的,是DMEM培养基) 205天前
    我更坑爹,昨天刚刚转染的原代细胞,二氧化碳没了,今天一看,感觉根本没转进去。。。。一般都是二氧化碳的事儿,有二氧化碳,一会儿就回复了
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 BMDM消化的问题 220天前
    确实有文献报道说GM-CSF诱导的BMDM是M1-like的,而M-CSF诱导的BMDM是M2-like的,但是因为我是用表面没有处理的培养板诱导的,GM-CSF诱导的反而是梭形而M-CSF诱导的BMDM是近似圆形的,LPS+IFN-gamma刺激24h后,确实形态变了。但是确实表面未处理和组织培养处理的皿诱导出来的BMDM形态是不一样的。
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 BMDM消化的问题 220天前
    我那时候没经验,EDTA没消化下来,就改用了冷泉港实验室的一个protocol,里面是用胰蛋白酶消化,按照protocol,先消化几分钟,换新鲜的胰酶,过几分钟,再换新鲜的胰酶,过二十多分钟直接用胰酶吹下来的,有一盘就还可以细胞能用,但是又一盘就完全不行,细胞彻底变圆了,因为我是用移液器吹下来的,不是用细胞刮子刮下来的。后来买了碧云天的细胞刮子还是铲子,但是好像是硬塑料的,不是软橡胶的,你们有木有推荐的好用的细胞刮子啊,我现在都是吹下来,实在吹不下来的用*头直接刮下来,太暴力了。
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 BMDM消化的问题 220天前
    我的细胞用的血清是GIBCO灭活的,很贵的,细胞形态也完全正常,就是有一次消化特别完美,后来就不行,我都用10mM EDTA消化11-12min了,可是没用,又用冰的PBS孵育,最后勉强吹下来的,虽然形态24h偏圆,可是48h确实又伸张了。但是我消化特别完美那次12h形态就恢复跟没消化一样了几乎!而且GM-CSF诱导确实非常难消化,M-CSF诱导的就不是这么难。你们有木有这种体会?而且我觉得可能确实是培养基的量或者细胞密度最后影响了BMDM的力学性质?我要做转染,最近被逼疯了,正在尝试诱导完不消化直接做转染了,要是成功了给大家汇报!
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 请教 - 利多卡因消化巨噬细胞的原理 223天前
    有木有人试着消化过GM-CSF诱导的BMDM,求指点。
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  悬赏10丁当求助 223天前

    BMDM消化的问题

  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 小鼠腹腔巨噬细胞的分离提纯 234天前
    我用30%FBS的培养基铺板的,几个小时以后换液比较合适呢?
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 分享小鼠BMDM培养心得(个人经验,欢迎指正和讨论) 235天前
    你细胞比较多,但是贴壁也不是很多,可能是中间夹杂了一些骨髓里面本来就有的巨噬细胞和基地膜细胞,他们也是贴壁的。你下次试试先养几个小时,出去贴壁细胞,然后诱导,这样才能知道10ng/ml行不行
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 分享小鼠BMDM培养心得(个人经验,欢迎指正和讨论) 235天前
    你可以试试加大到100,跟10ng/ml完全不是一个概念,细胞衰老是因为你消化有问题,不能刮,我刮下来一整个100mm培养皿一个活的都没有,我最近也准备试试RD的,我看丁香园上有说peprotech公司的细胞因子批间稳定性太差,我感觉100ng/ml我都加不起,10ug只能诱导5只老鼠啊,太坑了。
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 分享小鼠BMDM培养心得(个人经验,欢迎指正和讨论) 236天前
    我之前用过20ng/ml的该公司的M-CSF,几乎没有诱导成功。你要是不去掉骨髓里面本来就有的巨噬细胞,很难评估诱导效率,骨髓里面的巨噬细胞还是挺多的。红细胞好像有文献报道说是可以影响诱导巨噬细胞的表型。不过要是你5ng/ml就诱导成功,我真得取经,感觉细胞因子用不起,文献要求加到500U-1000u/ML M-CSF,按照这要求岂不是要加到500ng/ml?40ng/ml也试过,不行,诱导了一些,但是效率很低!
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 分享小鼠BMDM培养心得(个人经验,欢迎指正和讨论) 236天前
    而且中间需要去掉贴壁的骨髓里面的巨噬细胞。
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 分享小鼠BMDM培养心得(个人经验,欢迎指正和讨论) 236天前
    细胞因子浓度太低了你,红细胞得裂解。这个牌子的加到一百才有点感觉。消化用EDTA。胰酶用过,中间换了好几次新鲜胰酶,消化了20分钟,吹下来的。
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  : 有认证,有身份。我是医生,我通过了丁香园认证,拥有了专属身份标识和查看病例帖的特权,还得到了 30 丁当的奖励。你是医务工作者吗?一起来认证吧,首次通过丁香园认证还能免费获得 6 个月用药助手专业版会员http://dxy.me/MNZna2
  • dxy_mw8p01f3
    dxy_mw8p01f3  回复了帖子 提BMDM细胞,发现加入M-CSF后,培养了两天,细胞全死了 236天前
    我用的是peprotech公司的,100ng/ml,虽说 诱导的很少但是不至于死,按照500 U/ml加,我要破产了,但是文献一般也就20-40ng/ml啊,难道是我的细胞因子不行?但是至少不会死,我师妹在冰上过夜,第二天找我要的细胞因子,基本放了二十个小时,也诱导出来了。

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