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  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 做连接转化  TA克隆有经验的亲们在哪里啊? 43天前
    我之前跑了个载体的电泳图,跟质粒大小一样,然后我就把样品扔了
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  发布了新帖 做连接转化  TA克隆有经验的亲们在哪里啊? 48天前

    挑取了几个白斑,液体培养过后,提取质粒,电泳显示可能只有2.5k-3k之间,我需要插入的基因是2k多,载体也2K多,总和应该4 k多,估计没希望了,不进行PCR验证了,我已经从头到尾的第三遍了,PCR产物直接回收也变成切胶回收,即使条带有点淡,也不该连不上啊,怎么办啊,做了很久,大家可否给点意见,我一个板上挑了5个,都这样,要气哭了,是不是我傻

  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 74天前
    一个T
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 74天前
    不清楚具体加多少 我查了一下是固定步骤,类似试剂盒那种
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 75天前
    我们买的这个加A连接酶,和A碱基是成套的
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 75天前
    嗯嗯 谢谢 加A要么没起作用,要么就是加A太多,这是两种可能性,该如何改进啊,这也是个问题,是应该延长加A的反应时间和连接T载体的时间吗 ,还是说A碱基的量需要调整? 还有 如果是限制酶消化 具体该如何实际操作啊(虽然做不了,但是还想知道)?
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 76天前
    为什么要这样做,我不太懂,求教?如果是条件不允许做这一步,我应该如何保证加A和连接反应?同时你说有可能PCR产物污染,你说可能会是在哪一步,才会导致这种片段大于期待大小而且是单一条带,急,最近想重做,找不到修改的地方
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 76天前
    mpark这个是质粒为模板,特异性扩增得到的PCR图片,只有最后那个有可能是2K左右的就送出去了,结果是空载,我总共有3个基因,应该都是2Kb的,但是其他两个基因的都大于2kb. From what you have described, your PCR is likely contaminated. For cloning the PCR fragment, I am not sure how the ends of PCR products are processed before being linked with the vector. You have said that the PCR products are shown in a sharp band without ot
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 76天前
    mpark这个是质粒为模板,特异性扩增得到的PCR图片,只有最后那个有可能是2K左右的就送出去了,结果是空载,我总共有3个基因,应该都是2Kb的,但是其他两个基因的都大于2kb. From what you have described, your PCR is likely contaminated. For cloning the PCR fragment, I am not sure how the ends of PCR products are processed before being linked with the vector. You have said that the PCR products are shown in a sharp band without ot
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 77天前
    还有一个问题,纯化PCR产物,因为没有杂带,我直接采用液体回收的,对连接的影响大吗?
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 77天前
    没有进行限制性内切酶切割的载体片段,直接提取了质粒,特异性扩增了PCR产物验证了一下片段大小,送去测序了,结果是空载
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 77天前
    这个是质粒为模板,特异性扩增得到的PCR图片,只有最后那个有可能是2K左右的就送出去了,结果是空载,我总共有3个基因,应该都是2Kb的,但是其他两个基因的都大于2kb
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 77天前
    第一泳道是maker,最后一个泳道也是maker,中间的是质粒
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 78天前
    胶回收损失很正常 ,回收的时候PCR可能浓度太低了,你多加点PCR产物呗
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 78天前
    mparkHow big is the PCR product? How many As could be added to the ends of PCR fragment? Are you really think that ligation is fine at 16 C for 2 hours? The fact that your PCR screen turns out no insert indicates that there is no PCR fragment ligation with vector. You need to do more to have the PCR fragment linked to the vector. If A/T cloning is
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 重组质粒一直空载 78天前
    mparkHow big is the PCR product? How many As could be added to the ends of PCR fragment? Are you really think that ligation is fine at 16 C for 2 hours? The fact that your PCR screen turns out no insert indicates that there is no PCR fragment ligation with vector. You need to do more to have the PCR fragment linked to the vector. If A/T cloning is
  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  发布了新帖 质粒空载 79天前

    请问,重组质粒一直空载,蓝白斑也有,挑的白的,可是一直这样,老师让我从PCR开始做,但是我不知道问题出在哪里也没法动手,想问园子里面的经验贴大神们PCR做完之后 跑完电泳 发现没有杂带 直接液体回收的有没有影响 ?其实教我的那个同学告诉我在TA克隆阶段不混匀,有没有影响?

  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  发布了新帖 重组质粒一直空载 79天前

    请问,重组质粒一直空载,蓝白斑也有,挑的白的,可是一直这样,老师让我从PCR开始做,但是我不知道问题出在哪里也没法动手,想问园子里面的经验贴大神们PCR做完之后 跑完电泳 发现没有杂带 直接液体回收的有没有影响 ?其实教我的那个同学告诉我在TA克隆阶段不混匀,有没有影响?

  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  发布了新帖 实验讨论 85天前

    有没有分子生物学和基因这这方面的大神,求问

  • dxy_0wymhy04
    dxy_0wymhy04  回复了帖子 直接提取DNA的电泳图发现有两条带,且与目标大小不一致 167天前
    应该是没提出来,有可能,应该是试剂的问题, 谢谢😜

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