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【求助】请问谁有clontech的pLVX-ShRNA2质粒

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【求助】跨膜TNF alpha基因序列

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【求助】POG44质粒

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  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 关于制备单抗腹腔冲击免疫小鼠死亡问题 70天前
    曾经遇到过同样的问题,估计是和操作有关系。抗原是否过滤除菌?
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 求助!小鼠脾脏中免疫因子可以用qpcr检测吗? 136天前
    一般组织标本做qPCR,要么使用专用的组织保存液,冻存在-80°,要么直接液氮研磨后,加入trizol充分裂解后,冻存在-80°;直接匀浆放在-80°的情况不多,最好是尽快用trizol裂解后把实验做了。
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 (请教)T细胞表位刺激细胞增殖 136天前
    描述的问题不是特别的有针对性,是不是需要做T细胞体外培养中使用目标抗原刺激T细胞的增殖?健康人按理来说也是可以的,只是不如目标患者的好,因为目标患者体内可能有存量的针对你的目标抗原的特异性T细胞,所以在受到目标抗原刺激的时候,会迅速增殖;特异性的T细胞识别目标抗原需要形成抗原/MHC复合物,所以如果你要做这个实验,我觉得直接向体外培养的纯T细胞中加入可溶性的抗原或者多肽应该是没有什么效果的,最好是分离供体的DC,诱导成熟后,负载你的目标抗原肽,然后再加入T细胞中,进行体外刺激。
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 最近遇到纯化方面的一个难题 136天前
    目的蛋白8kDa很小,切掉MBP标签后,SDS-PAGE确定在下面小分子量部分是有条带的?而不是loading buffer?
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 包涵体蛋白纯化求助 136天前
    试试盐酸胍溶解包涵体?
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 蛋白除盐 295天前
    不能这么做。而且一定要保留一定的体积,不然你的蛋白样品就全部损失了。比如一直保留1mL的样品在超滤管里,离心后,再添加你需要的缓冲液,继续离心至1mL,再添加,再离心,一般三个循环过后就可以了。记住千万别离干了
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 镍柱纯化后还有杂带去不掉 299天前
    只靠单一的方案很难把蛋白弄到很纯,可以考虑加上离子交换看看
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 T7E1酶切检测crispr 突变位点 739天前
    我误导谁了呀。自己不会去查呀,懒惰到这种程度还好意思做科研,等着数据从天而降吗,简直是对你这种喷子无语了。
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 CRISPR文库构建时涂板菌总是长得太少怎么办? 820天前
    提几点小的建议,供参考:1.T4 DNA连接酶进行16°C过夜连接;需要做一下对照,将酶切后的载体做一个自连的反应,同样操作,看一下会不会长克隆;2.连接产物使用Glycogen进行沉淀,用无菌水重悬后再电转;这样电转的效率会高一些。3.你的回收产物浓度都太低了,尽量多做一些,让浓度高一些;
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 求助……shRNA连接转化后不长菌 846天前
    你的退火程序有问题。建议:Oligo退火体系中的缓冲液直接用1X NEB Buffer 4,退火温度更改为94度5分钟,然后关掉水浴锅,自然冷却至室温(一般需要overnight)
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 请教腺病毒载体相关 889天前
    直接活体尾静脉注射不行吗?大部分腺病毒会在肝脏富集
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 关于体外转录!!!!! 889天前
    用氯化锂沉淀,然后再做醋酸钠+酒精沉淀就可以了。不要用酚氯仿的方案,损失较大。还有,in vitro transcription出来的RNA,跑胶看起来有点smear的样子,是正常的,不一定是降解了
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 目的蛋白大小求助 889天前
    你这个是正常的,我觉得应该没有问题,marker有时候也不是那么精确的。
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 T7E1法检测基因敲除引物设计问题 889天前
    以B为中心,上下游各+300bp左右分别设计上游引物和下游引物序列,把PCR出来的wildtype的片段和你挑取的单克隆的片段混合后进行退火,然后用T7E1去切,如果在B的位置附近发生了indel mutation,那么T7E1的酶切的结果应该是出现一条短的300bp左右的片段,如果没有mutation,那么就是600多bp的大片段
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 CRISPR用高浓度药筛后是否还一定要有限稀释法挑单克隆? 889天前
    还是要挑选单克隆,可以考虑把你的iPS去辐照一下当饲养细胞
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 SH-SY5Y细胞新手求教 894天前
    将买来的0.25%的胰酶用PBS做个5倍稀释再用;把培养基吸走后,加入PBS洗涤2次,然后加入稀释后的胰酶,放入37°培养箱1-2分钟,这样操作可以充分消化分散细胞,又不至于消化过度使细胞受损。SH-SY5Y这个细胞生长比较慢,不要急于传代,传代的时候也不要过分稀释,先从1:1慢慢扩大。
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 我放在-20摄氏度中的组织,请问各位大神能不能做石蜡切片。应该怎么做? 1080天前
    固定后的组织在室温下也可以放置很久很久的,但是不建议在固定液中放置太长时间,大部分的固定液都是蛋白交联剂,可能后期做组化的时候,抗原无法修复,导致免疫染色失败。新鲜的组织取下来后,未经处理,直接丢进冰箱冷冻了,组织结构会被破坏掉,不建议使用。
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 腺病毒包装求助 1093天前
    需要一点耐心,CPE现象有时候需要反复感染2-3次才会出现,因为可能初始的stock滴度比较低。一旦开始出现CPE,再扩增就很快了
  • david_xmu
  • david_xmu
    david_xmu  回复了帖子 请教一个关于qpcr内参的问题 1109天前
    木有问题的,可以分析的。反正最后目的基因要和对应的内参基因进行校正的

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