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  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 孔板中静置培养的CHO细胞难以适应悬浮震荡培养,有什么好的解决方法吗? 440天前
    没有检测过细胞密度,在24孔板中静置培养3天后转移至6孔板培养,体积是2ml,培养3-4天。也有部分细胞长不起来,但比例不高,大约在10%以下。您的情况可能跟培养基、接种密度有关。
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 孔板中静置培养的CHO细胞难以适应悬浮震荡培养,有什么好的解决方法吗? 440天前
    具体是什么情况,结团或者是生长速率慢?在哪个阶段出现这种情况,是96孔转24孔的时候?个人经验,细胞从96孔板转移到24孔后仍然是静置培养,细胞扩增后转移至6孔板就采用振荡培养。振荡培养对细胞密度有一定的要求,密度太低很难长起来。
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 细胞株稳定性问题 441天前
    《生物技术药物研究开发和质量控制》第三版(王军志主编)第61页,不过不属于法规,算是行业标准吧。
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 如何检测重组DNA在宿主细胞中的整合位点 441天前
    具体流程可以参考TaKaRa genome Walking Kit说明书以及TAIL-PCR原理。这种方法的优点是可以定位至染色体具体位置,缺点是没办法定位所有目的基因的位置,特别是对于MTX或MSX加压扩增后的细胞。
  • cyzhgt
    cyzhgt  加入了调查派 969天前
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 大牛们说一说单抗药宿主蛋白检测的事吧 1403天前
    对啊,空载体转染细胞是不是也有些问题,如你所说的空载体拷贝数等,还要考虑整合位点,另外即使是同一个载体转染筛选的不同细胞株蛋白谱差异都比较大,何况是有无目的基因的两个载体呢。空载体转染的稳定细胞株筛选标准怎么把握、验证也是个问题。
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 如何检测重组DNA在宿主细胞中的整合位点 1412天前
    tail-pcr可以检测到整合位点在基因组的具体位置,southern blotting或qpcr可以检测拷贝数。注册要求好像是要求拷贝数和整合位点都要检测吧。有关注这方面,实际操作经验比较少,当时做tail-pcr也只是好奇目的基因的整合位点而已。
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 如何检测重组DNA在宿主细胞中的整合位点 1413天前
    Takara有这项服务 DNA侧翼未知序列获取(非安利) 基本原理是Tail-PCR,主要难点是在简并引物的设计上。PCR扩增后胶回收送去测序,然后根据测序结果和宿主细胞基因组比对,可得到整合位点。 我自己做过一次,成功了,不过试了6个简并引物才做出来。
  • cyzhgt
    cyzhgt  的帖子被加了2分 1447天前

    回复:关于生物反应器乳酸和pH的讨论

    根据@ggghhhh @六年一世 @pcpccp @rxh813 的建议,我对培养条件做了一下改变:(1)改用大泡通气,溶氧电极用空气校正,设置为60%;(2)搅拌速度改为100rpm;(3)pH设置为6.8,上罐时pH为7.1,暂不调节(ACID 泵不接酸)。细胞生长正常,最高...
  • cyzhgt
    cyzhgt  的帖子被加了1分 1480天前

    回复:关于生物反应器乳酸和pH的一些问题,求大虾指点

    rxh813 我想问一下,你们的这个实验中,pH值设置为7.0,我想应该有个范围吧,如pH=7.0±?,可否告诉一下你的pH设置范围?参数设置为7.0,实际变动是在6.95-7.05,在control上PID部分设置。准备下次实验将pH设置为6.7-6.8试试,做了...
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 关于生物反应器乳酸和pH的一些问题,求大虾指点 1480天前
    参数设置为7.0,实际变动是在6.95-7.05,在control上PID部分设置。准备下次实验将pH设置为6.7-6.8试试,做了几次2L罐都没有成功,有点灰心。。。另外,我做摇瓶实验时,将摇瓶盖子打开,迅速测了pH与pO2,pH为6.85,pO2为70%,不知道这个参数有没有...
  • cyzhgt
    cyzhgt  的帖子被加了1分 1480天前

    回复:关于生物反应器乳酸和pH的一些问题,求大虾指点

    六年一世 乳酸多是细胞生长变差的一个现象,就好比感冒了会咳嗽,但要吃感冒药而不是止咳糖浆你的转速比较低,却依然维持着50的溶氧,估计你的通气量很大,这对细胞不好,建议提高转速,降低底部通气量试试,方式还是用无泡的吧另外氧气校正的溶氧电极啥意思,纯氧中校正100%?在生物反应器的细...
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 关于生物反应器乳酸和pH的一些问题,求大虾指点 1489天前
    谢谢pcpccp的建议!!之前也试过用罐子模拟摇瓶的条件,就是不用碱调节pH,在pH大于6.6细胞生长比较正常,乳酸浓度也相对较低,小于6.6细胞活率降得很快,但是还是不太敢将pH设置为6.6,怕影响糖型。操作应该没有问题,我上罐之后取出30ml在摇瓶培养,正常。等细胞准备好了再...
  • cyzhgt
    cyzhgt  的帖子被加了1分 1490天前

    关于生物反应器乳酸和pH的一些问题,求大虾指点

    各位大虾:小弟最近在做5L生物反应器培养CHO-S细胞表达单抗,接种3天后检测乳酸发现已经有3.0g/L了,之后乳酸浓度一直升高,最高是7.0g/L,而且细胞密度也比较低(5*10^6),另外培养基pH下降比较快,进碱量比较多。培养条件:转速80rpm,溶氧50%(氧气校正的溶氧...
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 关于生物反应器乳酸和pH的一些问题,求大虾指点 1490天前
    在生物反应器的细胞状态是比在摇瓶的差。通气方式是持续通入空气,低于50%就自动通入氧气,这样做的原因主要是不持续通空气pH降得很快,7.5%的碳酸氢钠3天用了150ml。下次实验试一下转速调到100或者120rpm看看效果怎么样。是用纯氧校正100%,斜率是150nA左右。 请问...
  • cyzhgt
    cyzhgt  发布了新帖 关于生物反应器乳酸和pH的一些问题,求大虾指点 1490天前

    各位大虾: 小弟最近在做5L生物反应器培养CHO-S细胞表达单抗,接种3天后检测乳酸发现已经有3.0g/L了,之后乳酸浓度一直升高,最高是7.0g/L,而且细胞密度也比较低(5*10^6),另外培养基pH下降比较快,进碱量比较多。培养条件:转速80rpm,溶氧50%(氧气校正的溶...

  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 抗体相关书籍-Handbook of Therapeutic Antibodies, 2nd Edition, 2014 1560天前
    请问楼主在哪儿下载啊?没看到下载链接。。。
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 全套 Methods in molecular biology 下载 2624天前
    很好啊 谢谢!!
  • cyzhgt
    cyzhgt  回复了帖子 第三代测序的几篇重要文献(补上三篇牛文) 2940天前
    非常感谢啊!!

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