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【原创】定量Western Blot技术--蛋白功能研究新利器

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【讨论】生长素提取、纯化和测定方法

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求DR5启动子片段, GVG启动子片段

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  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 专题申请,长期有效 38天前
    我要建“单细胞研究”专题。单细胞测序被Science和Nature多次评为年度突破技术,正在改变科学研究和临床实践的方式方法。我是一名生化与分子生物学专业毕业生,从事基因检测行业相关工作10多年,长期关注单细胞测序研究和应用。随时单细胞分离建库的技术日趋成熟和测序成本的不断下降,单细胞研究即将成为一种常规方法进入科学研究和临床实践。基于以上原因,所以希望能建立一个专题,把相关内容整合在一起,方便大家学习交流。谢谢
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 单细胞测序工作流程 39天前
    总结 在过去的十年中,随着细胞分离新技术和单细胞测序新方法和新应用的发展,单细胞鉴定和研究领域取得了重大进展。这些进展为单细胞测序工作流程的每个步骤(从单细胞制备到数据分析)催生了大量可用的商业化解决方案。随着单细胞分离和检测的选项越来越多,实验方案的多样性显著增加,每种方案都有其固有的优缺点。因此,研究人员面临着诸多决策问题,例如细胞通量、测序深度、所需转录本长度、是否应纳入表观遗传或蛋白水平测量等。 想要充分利用单细胞测序来阐明复杂的生物系统,精心设计实验和优化工作流程的每个步骤至关重要。研究人员必须有明确的生物学目标和合理的实验设计,才能选择出针对其研究问题的最佳方法。在这里,我们概述了单细胞测序工作流程的每个步骤,讨论了每个步骤的重要注意事项和潜在挑战,介绍了商业化产品,并为设计和开
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 单细胞测序工作流程 40天前
    第 4 步 :数据分析、可视化和解读 简介 单细胞测序运行完成后即可进行下游分析。一般来说,单细胞测序实验的分析流程包括三个阶段:初级分析(碱基检出)、二级分析(多重分离、比对和遗传鉴定)和三级分析(数据可视化和解读)(图 8)。目前还没有针对单细胞测序实验统一的分析流程。流程中的每个步骤都有许多方法和软件程序可供选择。研究目标、单细胞分离平台和一般的实验室考虑因素将在很大程度上决定使用的特定分析流程。本章节概述了单细胞测序分析的步骤和一些可用的工具。 图8 : 单细胞测序分析流程示例 - 包括初始文件转换、初级分析、二级分析和三级分析的单细胞测序分析流程示例。 初级分析:文件转换 *.bcl 文件格式 Illumina 测序系统生成的原始数据文件为二进制碱基检出(BCL)格式。这种测序文
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 单细胞测序工作流程 41天前
    第 3 步 :测序 简介 分离出活性单细胞,提取感兴趣的遗传物质,制备好文库后,就可以进行关键的测序步骤了。所有Illumina 测序平台均采用边合成边测序(SBS)技术,全球90% 以上的测序数据都是基于该技术产生的。15 Illumina SBS 技术是一种专利方法,能以大规模并行的方式在单个碱基掺入不断延伸的DNA 链时对其进行检测。Illumina 测序系统单次运行可以输出的数据范围从30 万碱基到数万亿碱基,取决于仪器类型和配置。本章节介绍了适用于单细胞研究的Illumina 测序系统,讨论了确保测序成功运行的重要注意事项。 兼容的测序系统 虽然Illumina 测序系统都能够对单细胞文库进行测序,但是单细胞测序实验选择的测序系统主要取决于研究的问题和规模。推荐使用以下系统进行单细
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 单细胞测序工作流程 42天前
    第 2 步 :单细胞分离和文库制备 简介 有多种方法可用于单细胞的捕获和分离,应主要根据研究问题和样本类型来选择最佳方法。同样,有多种技术可用于分析分离细胞的基因组、转录组、表观基因组和蛋白组,选择的方法将决定文库制备、测序和下游分析的方法。本章节讨论了可用的单细胞分离方法,重点介绍了对分离细胞进行全局表征的技术。 单细胞分离方法和平台 单细胞分离方法可以根据通量来区分。低通量方法包括手工操作或细胞分选/分离技术(例如FACS),每次实验能处理几十个,几百个甚至几千个细胞(表 4)。微流体技术的进展使高通量单细胞分析成为可能,利用该技术,研究人员可以在一次实验中经济有效地检测成千上万个细胞(表 5)。 文库制备 单细胞测序工作流程的下一个关键步骤是文库制备。有多种可用的方法,但选择的细胞
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 单细胞测序工作流程 43天前
    第 1 步 :单细胞制备 简介 大多数单细胞分离平台都需要有活性、单分散的样本,然后才能进行分离或固定。组织类型、物种和动物年龄都可能影响从组织中分离活的单细胞。本章节介绍了制备有活性单细胞悬液的一些主要注意事项。 裂解 在任何单细胞研究中,单细胞悬液的制备过程都是造成差异的重要因素。1 细胞聚集成团或细胞死亡率高的样本会影响数据质量,导致错误解读。非贴壁细胞(例如外周血单核细胞)通常比贴壁细胞或从组织中分离的细胞更容易进行单细胞处理。不同组织胞外基质(ECM)的组成和细胞结构可能存在显著的差异,应针对特定的目标组织优化实验方案。2 传统的组织裂解方案有机械分离法、酶解ECM 法和组合方案(表 1)。 富集 在单细胞制备中,富集特定的细胞群,或去除不需要的细胞群(包括死细胞)是一个可选的步
  • cypzyf
    cypzyf  发布了新帖 单细胞测序工作流程 44天前

    随着细胞分离新技术和单细胞测序新方法和新应用的发展,单细胞鉴定和研究领域取得了重大进展。这些进展为单细胞测序工作流程的每个步骤(从单细胞制备到数据分析)催生了大量可用的商业化解决方案。  随着单细胞分离和检测的选项越来越多,实验方案的多样性显著增加,每种方案都有其固有的优缺点。因此,研究人员面临着诸多决策问题,例如细胞通量、测序深度、所需转录本长度、是否应纳入表观遗传或蛋白水平测量等。 想要充分利用单细胞测序来阐明复杂的生物系统,精心设计实验和优化工作流程的每个步骤至关重要。研究人员必须有明确的生物学目标和合理的实验设计,才能选择出针对其研究问题的最佳方法。 单细胞测序专题:https://h.dxy.cn/illumina/kz/solution 在这里,我们概述了单细胞测序工作流程的每

  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 关于数字PCR技术问题 44天前
    我觉得应该从实验操作方面去做些优化,从数据分析上是不容易解决问题。 比如:雨点多可能是:样品扩增体系里面有抑制剂、引物扩增效率或者是模板有二级结构等原因。针对这些原因去做优化比较合适。
  • cypzyf
    cypzyf  加入了调查派 1110天前
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 实时荧光定量PCR技术请教? 2170天前
    我有CFX的分析软件,如果不介意的话,可以把结果的原始文件发我的邮箱(ycao2011@126.com),可以帮你看看是怎么回事。
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 PCR Tm值 2173天前
    PCR反应建议用温度梯度摸索一下最优的反应条件,条件确定之后再割胶回收。 割胶回收的时候,尽可能让目的条带分的开一些,换句话说就是让片段跑远一点;然后割胶回收时尽可能将条带切细一点,因为有可能你看到的条带其实可能是多个片段,如果切的太粗会将不同的片段同时回收。 如果回收产物测序不...
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 如何选择管家基因 2174天前
    个人觉得这3个内参都不一定合适,这3个基因的表达量都很高,与目的基因差异很大。另外,这3个基因都有假基因,不能代表mRNA的量。
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 崩溃的qpcr结果,求助 2174天前
    换个质粒跑一下看仪器有没有问题吧。或者换台仪器做做看。
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 PCR无目的只有二聚体 2174天前
    你是不是做RT-PCR,如果是检测mRNA,Actin可以出来,但目的基因出不来,也有可能是基因表达量太低。 个人认为:扩增不出来,可能是模板的原因,也可能是引物的原因。Actin能出来只说明试剂、仪器和方法没有问题。
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 琼脂糖凝胶分辨多个小条带不清,求助 2174天前
    片段大小相差太小,琼脂糖估计很难区分,建议用聚丙烯酰胺凝胶电泳,或者毛细管电泳等方法检测。
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 一个荧光定量PCR的问题,**大神解答 2174天前
    建议上图给大家看看,不然不知道应该怎么回答。
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 中山大学附属肿瘤医院面试经验 2174天前
    恭喜恭喜!
  • cypzyf
    cypzyf  回复了帖子 PCR 最新技术原理、方法及应用2011(中文完整版) 2174天前
    谢谢分享,好东西。

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