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【专题讲座】生物大分子分离纯化方法

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【原创】常见重组蛋白纯化

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  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 19天前
    浮梦一生得多失少 chromatography 阶段洗脱更好控制和放大。 那线性洗脱怎么操作呢,我们这里没有检测器控制器啥的,我们只有一个单独的柱子,手动上样的 可以自己做梯度混合器,两烧杯加个盐桥。要不就阶段洗脱。
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 21天前
    浮梦一生得多失少 chromatography 我不是很明白,如果上柱都吸附,那只能在洗脱用不同的盐浓度仔细看哪个浓度能分开,不过我没有做过,不很清楚,你可查查相关文献,我记得有书制备这类酶的,如生化制药类的书,应该是比较成熟的 还有就是想请问一下,关于线性洗脱和梯度洗脱的区别有什么 阶段洗脱更好控制和放大。
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 21天前
    dxy_1txp1lu7 请问链霉蛋白酶应该如何提取纯化? 查文献看看。这个蛋白我也不熟悉
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 NHS填料的厂家推荐 27天前
    其实超简单,1,填料不能接触水,酸洗越快越好,洗完千万不能用偶联缓冲液洗。然后直接加入偶联蛋白溶液中,蛋白溶液预先加1%碳酸氢钠
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 29天前
    cloveseven 老师您好,蛋白表达纯化新人求助,我用大肠杆菌和pET32c质粒原核表达一个蛋白,得到融合目的蛋白后使用肠激酶切去trx-tag和his标签,再上镍柱纯化得到目的蛋白。目前经肠激酶切得到的目的蛋白不能直接流穿,提高咪唑浓度30mM~180mM梯度洗脱后,目的蛋白、肠激酶和trx蛋白就都被洗脱下来了,求问我应该怎么办才能将目的蛋白分离出来? 直接在柱子上或者填料上进行酶切试试
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 34天前
    吴辛辛 我有一个GST 融合蛋白,分子量在99kd,pI为8.1,0.1mM 的IPTG 16℃诱导20小时后用溶菌酶裂解(buffer 的pH为7.4),发现上清中没有目的蛋白,都以包涵体形式存在在沉淀中。请问我该如何再优化实验? 这个我不是很清楚,你换个破碎的方法或pH试试看能否可以得到可溶解的蛋白。否则你只能复性
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白纯化求助 63天前
    阴柱通常是用Tris-Hcl缓冲液
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 包涵体蛋白过Ni-柱纯化 63天前
    变性条件下挂柱不好的原因大多还是标签暴露不充分,可以考虑溶解和平衡柱子的缓冲液都用6M盐酸胍,其他条件不变试试,当然其实GE镍柱挺多的,不知道用的哪种,有条件也可换个填料试试
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    chromatography  回复了帖子 GST蛋白纯化 68天前
    这个亲和很难去除,GST条带通常的原因是表达到标签就终止或者是部分质粒没有嵌入目标基因,总之这是这个表达系统常见问题,可考虑填料或柱上酶切得目标蛋白,或者切后再过凝胶柱去掉标签和融合蛋白,以前有客户的生产工艺就这样做的,我们专门合成几升琼葡糖凝胶G40HP,让26KD以上的都走外水体积,如除盐去分离大分子很小分子,上样量可到填料体积20-25%。
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    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 68天前
    爱健身的生物狗 大佬您好,我是一个纯化蛋白的小白,请问纯化细菌蛋白的话 用Roche的 cOmplete™ His-Tag Purification Resin好一点还是用GE公司的 Ni Sepharose excel histidine-tagged protein purification resin和Ni Sepharose 6 Fast Flow histidine-tagged protein purification resin好一点 你说的这些填料都是纯化带his标签蛋白的,如果你的蛋白带这个标签,我决定它们都应该可以,选择哪个便宜点就好,钱多另当别论。国产的也可以,不过尽量选择载量高点的,说明填料作用力强,这样对于作用力弱的蛋白能更
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 68天前
    胖橙啊 老师您好,目的蛋白是包涵体蛋白PI在8.15,30Ka左右,过镍柱复性后用凝血酶切割组氨酸标签,请问有什么方法可以在去除凝血酶的同时也达到纯化的目的吗? 这个不容易,不过看看有没有带标签的酶,如果没有那你可考虑亲和去酶,或者柱上复性,柱子上切,这样纯化会容易点。
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 68天前
    wf1122333 楼主,求助!我用8-14k透析袋分离总蛋白液的大分子部分和小分子部分。小分子部分减压浓缩后有很多盐,该如何除盐?溶解都很费劲 1万以下,1200以上的分子除盐可选择琼葡糖凝胶G15,1500以上还可选择葡聚糖凝胶G15,700以上的可以选择葡聚糖凝胶G10
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 68天前
    浮梦一生得多失少 您好! 我想请问一下,关于胰糜蛋白酶的分离与纯化的问题,用琼脂糖的阳离子柱和苯甲眯亲和柱一直做不出来,洗脱中会同时含有胰蛋白酶和糜蛋白酶。 但是上柱透过时确确实实是没有胰蛋白酶。 还有就是可以用离子交换树脂可以分离两者吗,他们含有大量的杂蛋白 我不是很明白,如果上柱都吸附,那只能在洗脱用不同的盐浓度仔细看哪个浓度能分开,不过我没有做过,不很清楚,你可查查相关文献,我记得有书制备这类酶的,如生化制药类的书,应该是比较成熟的
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 131天前
    已经回复短信,其实这个IDA(亚氨基二乙酸)配基的填料,我们的叫IMAC琼脂糖凝胶FF,有货的
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    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 140天前
    这个很难说,你可以在柱子上或者填料上且试试
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 147天前
    酶切有种类和浓度等不同,效果也不一样,所以我觉得酶还是首选。如果相互作用是电荷作用,加盐有效,如果是疏水作用,加盐适得其反,只能加甘油,PEG,乙二醇,甚至乙醇等。所以盐不管用换个思路看看。PEG,甘油这些物质低浓度能降低疏水相互作用,同时黏度大可降低热运动,避免聚集沉淀,对生物分子通常起保护作用,一般可用2-5%试试,PEG分子量越大。黏度越高,所以低分子量的就可。分子实验中破碎细胞但不破碎细胞核达到分离完整细胞核的作用,这个我不熟悉,你自己摸索,希望有帮助
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 148天前
    1。是否可用DNA酶切小后上凝胶柱去掉,或者看加盐等别的物质避免它们之间的相互作用。您再看看相关材料。2。高盐情况下疏水相互作用会使蛋白或别的生物分子重新吸附到离子柱子上,从而难洗脱,这个现象上学时候就发现,高盐时DEAE可以当疏水柱挂蛋白。不过病毒也许特殊,它进入不了填料内孔,所以也许是吸附或者聚集堵在填料颗粒间,所以我觉得你可在样品和洗脱液加点聚乙二醇,甘油等增加黏度,同时降低疏水相互作用试试,好运。
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 148天前
    这个我不很清楚,你跑非还原电泳看看,不同来源蛋白不一定一样
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 148天前
    superdex 75分离上限8万左右,而且颗粒 更小,分离效果更好,而sephacryl S-100(或者200)分离范围更宽,颗粒更大些,因此选择前者,但是55 58太近,即使这样怕也难分开,最好是能离子或疏水只剩下大的和小的才有可能用凝胶柱分开。
  • chromatography
    chromatography  回复了帖子 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:) 190天前
    Ni-NTA通常吸附蛋白的能力弱于普通的镍琼脂糖凝胶,所以换个普通的镍柱试试。此外上样的缓冲液和蛋白的溶液可提高pH到8.5,也可增加吸附能力.

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