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  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 求助:同一质粒为什么不能转入同一种细菌的不同分离株? 8天前
    不了解艰难梭菌。不过这种转化方法是通过mating 的方式吗?如果是, 那么需要F+ 到F- strain. 你分离的菌株是F- strain吗? 物理强攻可行吗?可以考虑电转
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 WB内参出,目的蛋白不出 10天前
    做科学研究是要花钱的,该花的钱,不能省。比如:GAPDH作为内参通常都是非常容易检测出。如果不是用特别强的变性,还原甚至辅助热变性方法,都很难从膜上将已结合的anti-GAPDH洗下来。你说的这种情况,算是极少见了。说明抗体已经过度稀释,或者效价大幅下降所致。用这样的抗体,来做研究。得出的结论很值得怀疑。所以省钱需要慎重!
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 QPCR 曲线异常,如何解决 10天前
    1. 你用的是染料法还是探针法?一般意义上来说,染料法特异性要差一些,无法确认扩增是否特异。 2. 楼上说的有道理,但是阴性对照没有发生异常,如果该现象反复发生,不呈现随机性,比如仅仅在样品重复间发生,那么气溶胶污染的几率并不高。 3. 你所使用的复检是什么方法?如果还是PCR方法,那就意味着重复性差。有些老设备Ct在30以上的结果就不太稳定,尤其是当使用染料法的时候。所以可以考虑大幅提高模板量,使得Ct前移,提高检测精确度。 4. 如果是其他方法,如电泳复检证明是阴性,那么说明PCR结果为假阳。需要考虑1. 排除设备自身误差,同3;2. 考虑污染,即模板有可能含有少量其他模板(阴性正常,因此考虑除模板外的PCR体系均正常),导致非特异性扩增。探针法也不能排除,需考虑探针特异性。考虑引物特异
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 每月细胞版风云战友奖励专用帖 10天前
    得分第六,谢谢
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 PBMC污染?真菌污染?很奇特稳定的一种污染,是来源于血液吗?求鉴定和指导 28天前
    一般细胞都在恒定温度条件下培养,而且很多细胞实验室多处于恒温状态,所以天气转凉,温度导致污染源减少的说法,概率比较低。 持续更新换液会降低“污染”,那么“污染”源来自细菌,真菌的机会不太大。常见的支原体污染,一般难以观察到可见沉积物。所以我还是怀疑可能是早期PBMC分离时,带入的血纤蛋白等杂质,形成的沉积物。在换液过程中,稀释或者由于细胞吞噬,逐步消失。不管怎么样,祝你实验顺利!
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 荧光PCR扩增曲线高浓度趴下 28天前
    有可能存在基质抑制,或者杂质干扰。如果确认手工提取能消除该现象,那么可以首先考虑优化提取仪的提取方案,比如:增加洗涤。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 想请各位老师帮忙分析下条带跑得不好的可能原因,最近跑的背景都很脏。 29天前
    做得还好吧,没觉得背景过高。半干转膜通过高电压,达成快速转膜的效果,一般不需要中途补液。下图中看到的主带下面的染色区域,可能需要调整封闭,一抗,或者二抗孵育条件来改善。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 构建的重组质粒表达不出来 30天前
    你的插入序列看不到酶切的接头。无法得知你是怎么插入载体的。最重要的是测序结果,是否能确认表达元件正确?
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 构建的重组质粒表达不出来 30天前
    建议: 1. 确认是表达量低还是未检出表达。最好用WB来确认 2. 如果是第一次使用这个表达质粒,在确认未检出表达后,需要考虑载体是否构建正确。重新确认测序结果,注意需要包含启动子之后的所有序列。留意表达元件的的阅读框,起始密码子位置是否有误等涉及表达的因素。 3. 通过PCR,确认你所挑选色BL21转化克隆,确实含有目的载体。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 这个杂交瘤细胞是污染了么? 32天前
    看不清楚,不过不像是污染。也许是饲养层细胞比较多。你应该是逐步换液,为什么是补了一滴HAT?
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  的帖子被加了1分 34天前

    回复:PBMC污染?真菌污染?很奇特稳定的一种污染,是来源于血液吗?求鉴定和指导

    关于血纤蛋白,我没有实验证据。仅仅是猜测。这种蛋白主要来自血浆,一般细胞分离出来的组分很少含有高水平血纤蛋白。这是一类蛋白在激活的凝血酶这样的蛋白酶作用下,会形成不溶性的丝状沉淀物,累积在一起,起到凝血作用。如果你的PBMC分离时,带有少量血纤蛋白,就可能在一些蛋白酶作用下,形成...
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 细胞样本QPCR结果一会上调一会下调而且趋势还挺明显是什么原因? 37天前
    如果你想得出结论,干扰目标后对下游基因转录的影响,确实需要多做几批,确定误差范围。 此外,你还需要考察一下,这三批产生误差的原因。比如你重复检测后,均出现显著上调或下调,那就需要考虑这三批有什么差异了,比如:细胞分化状态,细胞密度等等。需要考虑控制重复间的一致性。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 细胞样本QPCR结果一会上调一会下调而且趋势还挺明显是什么原因? 37天前
    你给出的信息不够多,难以具体分析。除去一般的分析,很多人常常会忽视系统误差问题。 你所谓上调或下调,分别是上调或下调了多少?参考标准是什么?除去人为操作问题,以及样品处理未注意到的一些问题,有些时候,定量的误差,或者说整个实验的系统误差,有可能回覆盖你所谓上调或下调的幅度。所以,首先应该确认,考虑到系统误差情况下,样本间是否还真具备显著的差异。 定量PCR涉及RNA抽提,反转录,以及PCR定量。涉及环节众多,会引入的系统误差也多。除此之外,你所考察的靶基因,转录水平变化,是否会导致内参标志物转录变化等等问题,都需要回顾。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 菌株鉴定公司做的ITS测序报告,一点看不懂,该怎么把结果用到文章里呀?求解惑 38天前
    ITS是条码基因,可区分微生物种间差异。一般检测结果应该是与数据库进行比对blast,得到的同源相似度。Hu-Fun 和TM-Fun不太清楚是什么。如果是对两个数据库进行比对的结果,有两种微生物与检测结果相符,则意味着你的样品可能是个混合物。可以问你的服务公司,确认这两列是什么。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 MBA-MB-231有没有可以在96孔板低吸附的板子里成球的培养方式 39天前
    3D培养板可以实现。PE有这样的耗材
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 求助,Reviewer关于免疫荧光的意见叫我费解,求大神指导。 39天前
    意思是你这两个marker的免疫共定位,并不实际与细胞的复极性直接相关。因此要求对文中涉及这样说辞的文字进行修改。这就看你做的是什么marker啦。审稿的意见是,这与你所论述的细胞极性不太相关。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 还原性电泳一直有杂带 43天前
    那就建议你考虑,增加loading buffer中的还原剂,比如再加入倍量的DTT或者b-ME; 延长蛋白沸水浴时间到10-15min。看看是否能解决问题。另外根据你的分子量,哪一条是预期的条带?如果分子量变小了,那么需要考虑是否有蛋白不稳定,或者修饰发生脱落的可能。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 还原性电泳一直有杂带 43天前
    1. marker的形态来看,凝胶还是可以。你的marker 没有高分子量marker 吗?为什么凝胶上半部分,很干净,没有条带,而且背景也很清晰?是不是染色不充分? 2. 从照片看,你没有加入浓缩胶,因此有可能目标蛋白会出现带型压缩不充分,连续拖尾情况 3. 如果可以排除还原剂的问题,加入loading buffer的变性时间,通常需要煮沸10min. 你的样品只处理了3min. 有可能是蛋白变性不充分,亚基或者多聚体分离不彻底。 4. 建议加入一个阳性对照标准品,比如:血红蛋白,作为参照,看看电泳以及样品制备过程是否会导致会出现所谓杂带现象。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 上清电泳一直没有条带,然而后续纯化却有目的条带,求解答 43天前
    你们老师给出的解释合理。如果你不追求高表达量,只要纯化后纯度,浓度,总量以及活性满足要求,那就可以了。不过从胶图看,你在不同咪唑洗脱条件下,一直都有蛋白被洗下。建议你做个WB,鉴定一下,是否都是融合蛋白。另外,从你的表达结构上看,标签在N端,会导致即便咪唑洗下的都是融合蛋白,但是会包含很多各种截断体,会出现你这种情况,目标蛋白表达不完整。
  • IgY_fellow
    IgY_fellow  回复了帖子 ELISA稀释的问题 44天前
    如果是竞争法的ELISA,标准品浓度越低,检测值就会越高。但是样品如果出现相反状况,可能是样品基质存在干扰,做做加标实验看看回收率,是不是符合要求。 顺便问一下,你的标准曲线做了吗?

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