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  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 质粒连接转化 48天前
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 质粒连接转化 48天前
    还算少的是少了多少呢?很多还是只有几个?如果只多了几个的话可能就是没连上,如果酶切连接没问题的话连接的比对照的会多很多
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 质粒连接转化 49天前
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 质粒连接转化 49天前
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切验证 49天前
    菌液PCR会出现假阳性,是不是没连上
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 质粒连接转化 49天前
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 质粒连接转化 49天前
    质粒酶切时有做单酶切对照吗?确定一下单酶切是否都能切开。你这种情况可能是有一端没有切开,或者连接酶失活了,有一部分没切开的质粒转化进去也会长出菌落。
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 57天前
    这两个酶切位点用的挺多的,后面又做了一次,经验证并不全是载体自连,是没切开的质粒转化进去了。之前一直没连接上并不是酶切的问题,应该是酶切后回收这一步的问题,之前用乙醇沉淀回收不行,现在改用胶回收已经连进去了。我分析具体原因应该是乙醇沉淀同时将内切酶回收回来了,在连接buffer中又恢复了活性,所以在连接的同时又在内切酶的作用下被切开了。不知道我分析的对不对。
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 58天前
    嗯,您分析的很对,今天看了下转化结果,酶切质粒直接转化和自连对照组都长出了十几个菌落,应该就是有部分质粒没有切开导致的,并不是自连。连接的实验组比对照组多长了很多菌落,回收条带虽然浓度低应该也连上了(还没有验证)谢谢各位的分析,给了我很大帮助
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 59天前
    嗯,谢谢,我又重新酶切了一次,胶回收的,等等看结果,只是感觉胶回收损失好多啊,特别是PCR产物,两次回收后也没剩下多少了
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 59天前
    谢谢您的解答我是按照两个酶的说明书上的量进行酶切的,用的是快切酶,酶切时间说只需要5-15min,我切了一个小时,不知道时间够不够。我后面又重新酶切连接了一下,同时做了一个酶切质粒直接转化的对照,看有没有没切开的。我很奇怪的是就算有没切开的,肯定切开的还是占大部分吧,也该有阳性的吧,怎么会全是阴性的呢。
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 62天前
    太感谢您的帮助了,我再重新酶切纯化试试
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 62天前
    没有,酶切后没有用胶回收纯化,直接用的乙醇沉淀回收的酶切产物,之前老板给的方法,说是以前用过,之前构建另一个质粒也用过这个方法成功过,就是阳性率不高。
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 62天前
    质粒 12μl(约3μg),酶各2.5μl,buffer cutsmart 5μl,ddH2O补至50μl,两个酶有通用的buffer,用的酶是快切酶,37℃切15min就可以,我怕酶切不完全,37℃切了1h,然后用乙醇沉淀回收的酶切产物,不知道对后续有没有影响,乙醇沉淀回收后内切酶还有活性吗?因为BamH I不能热失活,酶切完没有进行失活就直接回收了
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 63天前
    有二十多个bp,距离应该应该可以做双酶切吧
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 63天前
    BamH I用的是NEB的高保真酶,没有星号活性,有什么方法能确定质粒双酶切完全吗?
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 双酶切载体自连 63天前
    您好,谢谢您的解答,双酶切的话粘性末端不匹配,不是应该不会自连的吗?如果自连的话是不是说明有一端没有切开,但是分别单酶切又是能切开的。
  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  发布了新帖 双酶切载体自连 63天前

    pCDH质粒中连入500bp左右的片段,酶切位点为XbaI 和BamH I,质粒做双酶切时同时做了单酶切单酶切对照,,单酶切都能够切开,双酶切也能切成一条线型条带,插入片段为PCR产物,乙醇回收后做双酶切。16℃连接过夜后转化,长出的菌落PCR都是阴性,不加插入片段的对照组和实验组长出的菌落数量差不多,有时候对照组菌落甚至更多,已经做了好几次了,不知道什么原因,求解答

  • 麦芽v田田
    麦芽v田田  回复了帖子 胶体金免疫层析技术论坛 693天前
    新手请教各位大神,我做胶体金金垫上释放很干净,但在金垫和NC膜连接的地方有残留,加水和TRIS都能释放的很干净,不知道是什么原因?

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