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  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  回复了帖子 做native-page,蛋白跑不出来,希望有前辈答疑。。。 405天前
    我没有回收,之前只想看一下五聚体的,回收的话,应该可以透析吧,因为没加sds,所以蛋白理论上是没有变性的,是一个空间结构正确的蛋白
  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  回复了帖子 做native-page,蛋白跑不出来,希望有前辈答疑。。。 741天前
    好的,谢谢前辈!我下次时间缩短一半跑的看看,真的有可能跑出去,应该是蛋白比甲基绿跑的快
  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  回复了帖子 做native-page,蛋白跑不出来,希望有前辈答疑。。。 745天前
    没有Marker,有溶菌酶做个参照,我每次是甲基绿指示剂跑到最底下,就把电断了,我觉得您说的可能性存在,但是甲基绿分子量小,不是跑在最前面吗?既然甲基绿都还在,为啥蛋白会跑出去?
  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  发布了新帖 做native-page,蛋白跑不出来,希望有前辈答疑。。。 746天前

    本人做native-page,连续性胶,胶浓度10%,我是碱性蛋白,想要看五聚体,分子量大概在60-80kD,用的是低PH凝胶系统,上样用的是2*甲基绿上样缓冲液,跑之前离心过,但跑下来什么都没有,我做过SDS-PAGE,是有蛋白存在的,问题是非变性电泳就什么都没有,因为溶菌酶也是碱性蛋白,所以和样品一起跑,但溶菌酶能跑出来,溶菌酶浓度比我样品浓度高,是21mg/ml,样品浓度在0.7mg/ml,跑胶时,样品20微升+2*甲基绿上样缓冲液 20微升,望前辈们能指导一下。(注:也跑过非连续的胶,还是什么都没有)我的揣测:1.是不是我胶浓度太小,15%胶浓度行不行,或者,我的蛋白跑出去了??2.非变性的胶是不是需要样品蛋白浓度比SDS-PAGE需要的样品蛋白浓度高一些3.2*甲基绿上样缓冲液是不

  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  回复了帖子 Ni柱纯化His tag蛋白柱上复性的问题 768天前
    嗯,谢谢,我现在也是透析复性的,柱上复性太难了
  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  加入了调查派 783天前
  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  回复了帖子 Ni柱纯化His tag蛋白柱上复性的问题 885天前
    嗯嗯,谢谢
  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  回复了帖子 Ni柱纯化His tag蛋白柱上复性的问题 888天前
    问题1:我是用包涵体溶解缓冲液溶解包涵体,然后上柱(柱是1ml的预装柱),用的包涵体溶解缓冲液冲洗杂峰,复性是含7M,6M,5M一直到0M尿素的复性缓冲液,每个梯度2ml,速度我计算了一下大约是0.1ml/min,最后用150mm咪唑,200mm咪唑和500mm咪唑冲洗,检测之后,什么都没有。问题2:之前没做柱上复性,上样后,冲杂峰,然后直接用500mm咪唑洗脱(含8M尿素),有我要的蛋白,但也有一个杂峰。是不是要梯度洗脱就没有杂峰了。问题3:我做实验配的所有缓冲液都没有加2-巯基乙醇,这个有没有影响没发过贴,特别害怕沉了。。。谢谢您之前的回复。
  • 雨落烟起哈哈
    雨落烟起哈哈  发布了新帖 Ni柱纯化His tag蛋白柱上复性的问题 893天前

    我纯化蛋白,一开始没有做柱上复性, 上样,洗杂峰,然后直接用含8M尿素的洗脱液洗脱,洗脱出了我要的蛋白。但现在我柱上复性后,就洗脱不出蛋白了,准确的说洗脱的蛋白量很少,本来洗脱的蛋白是几毫克,现在就100多微克,很焦急,望前辈能指点指点,没有丁香币,希望前辈们帮帮忙。

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