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【求助】请问PCR buffer中tris-HCl的浓度应如何选择

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【求助】请问含硫酸铵的溶液能高温高压灭菌吗

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【求助】PCR体系不稳定,无法扩增出500bp以上片段

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  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 VEGF121和165哪个适用于EB法向造血干方向分化 6天前

    由于文献只说用VEGF(浓度20ng/ml),没有货号,采购时发现VEGF有很多种,重组的是165和121,哪个更适合造血方向分化,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 VEGF121和165哪个适用于EB法向造血干方向分化 6天前

    由于文献只说用VEGF(浓度20ng/ml),没有货号,采购时发现VEGF有很多种,重组的是165和121,哪个更适合造血方向分化,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求教核酸退火缓冲液的配方 56天前
    不是,我是退火接头连DNA片断或者退火sgRNA的N20连质粒
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 基因合成前的密码子优化问题 56天前

    之前没有做过类似的工作,第一次进行基因合成,对序列使用jcat进行了人的密码子优化和酶切位点排除,加入了cozak序列,但优化后GC%较高,达到67%-68%,很多连续的GC,请问这样的序列会不会影响转录和翻译,还需要用什么软件对序列的结构、GC%等进行优化,或者说GC%高就是对转录翻译有益,麻烦有经验的战友指导一下,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求教核酸退火缓冲液的配方 56天前
    我一般用1X pcr buffer,实际上就是需要一个稳定的PH缓冲和一定的盐离子浓度
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 慢病毒载体做瞬转现实吗? 56天前
    非常感谢您的回复,我还有一个疑问,在电转mRNA的试验中,一般能进入细胞的mRNA会是多少个拷贝呢?考虑到MOI的限制,使用这种设想的方案一次能进入细胞的mRNA理想了估计也是10左后,这样的浓度能否实现功能呢?比如CAS9,谢谢
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 慢病毒载体做瞬转现实吗? 57天前

    能不能去掉5‘LTR,3’LTR和CTTP/CTS,能不能实现正链RNA停留在细胞质内当mRNA用,再去掉POL,另外用的是3代包装质粒是不是RRE也不需要了。

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 PBMC冻存问题 57天前
    右旋糖酐,现在有右旋糖苷:DMSO=1:1的5x防冻液,买来直接用就行
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助伯乐电转仪 电转诱导生成IPS细胞 190天前
    最近也要做电转,cd34+,lonza要等很久,目前只有bio-rad的MXcell,楼主为什么不用脂质体的试剂盒,很多文献都是脂质体转的,我是悬浮细胞效率低没法子
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 有人用过DNase I和锰离子片断化DNA吗? 225天前
    谢谢,用锰离子试着切了效率很低还无法重复,所以直接买了试剂盒。
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 有人用过DNase I和锰离子片断化DNA吗? 246天前

    想将BAC DNA打断成平末端的DNA片断,DNase I说明书上说锰离子存在条件下可获得平末端,哪位高手用这种方法片断化过DNA,请给一个具体的buffer配方和处理程序,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助BAC DNA 提取污染问题 376天前
    酚氯仿限制使用买不到的,所以只能用磁珠法去除蛋白,异丙醇沉淀后两种检测方法差100倍,加磁珠纯化后比值缩小到30,说明对蛋白的纯化效果还是很好的,但无论liCl还是RNase A都不能把这30的比值去掉,电泳结果显示是RNA污染,liCl,RNase A处理后RNA带还在,比值还是30多.目前只有CTAB法能把比值控制在2以内(改进了qiagen plus系列试剂盒,直接使用试剂盒带的S3比值也是十几),但文献上说CTAB优先沉淀小分子线性DNA,而且回收率一般在20%以下,所以不太敢使用,目前提取质量最好的是阴离子交换柱法,nanodrop检测值和qubit检测值相符,但个位数的回收率实在是太低了.
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助BAC DNA 提取污染问题 376天前
    谢谢您的回复,有几个细节问题还想问一下1,BAC提取中出现这么高浓度的RNA是否正常?我们一次培养500ml菌液,OD2.2左右,按1OD=10^8cfu计算,大概应该有约200ugDNA,实际获得60ml菌体裂解上清液,qubit值为8-12ng/ul,既约600ugDNA,而RNA能达到20-30倍的产量?约1ml OD600=2.2的菌液能获得30-40ug的RNA,这是否正常?还是这些污染物根本不是RNA?2,我之前消化RNA体系过小了,DNA浓度为100ng/ul,RNA约3-4ug/ul,RNase A在100ug/ml浓度下每小时的理论降解能力是多少,我要将RNA稀释到什么浓度范围进行消化处理3.您提到加入100ul 10* buffer3,是不是就是buffer 3,是否要给
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 质粒pcr跑出目的条带,菌液pcr未跑出,为什么? 377天前
    菌液量太大,菌体内容物使反应体系崩溃,我之前也曾一个月都菌液pcr失败找不到原因,后来发现是用了缓冲能力较差的商品化PCR buffer,之前一直使用的是自配buffer,自配的tris-hcl浓度更高,而且加了BSA,原倍菌液只能用自配buffer扩增出来,稀释十倍后两种buffer都能扩增出来建议如果是过夜培养的浓菌液,至少稀释10倍后再按1/10加入到pcr体系中,或者使用缓冲能力好的buffer,50mM tris-hcl 8.5这种绝对不行
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助BAC DNA 提取污染问题 378天前
    如果是降解DNA的话应该是smear一片,各个长度都有,不会只是明显小于100bp的位置,电泳结果是前锋是大的亮团,消耗掉大部分的染料,最后面有一个较浅的大片段DNA带,没有smear。而且这个位置如果是DNA的话估计50bp以下了,是无法被异丙醇有效沉淀的吧;qubit只要是DNA双链都能测出无论长短,nanodrop值不会高出qubit检测值那么多
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助BAC DNA 提取污染问题 378天前
    对,更多更亮
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助BAC DNA 提取污染问题 378天前
    感觉上是完全没有起作用,比如消化或沉淀了50%的RNA,我觉得比值应该下降到十几,但2种方法都没有明显的改变比值,文献说licl对100bp RNA有效,RNase A也只是在C和U后切,难道这些都是小于100bp的小片段RNA?异丙醇对这么小片段的RNA也能有效沉淀?有什么办法去除呢?用PEG?
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 求助BAC DNA 提取污染问题 378天前

    想提取大量的高纯度BAC DNA,碱裂法后使用磁珠法纯化后nanodrop检测值比qubit检测值高出20-30倍,260/280比值接近2,电泳检测发现小于100bp位置有大量亮带,怀疑是RNA污染。采用碱裂异丙醇沉淀后 EB 溶解后加入RNase A到100ug/ml后37度孵育1小时后再磁珠法纯化后nanodrop比qubit依然高30多倍,电泳检测100bp前端亮带没有变化,怀疑没有有效降解RNA;采用异丙醇沉淀EB溶解后加入等体积5M氯化锂溶液-20度下放置30分钟后发现溶液明显混浊,15000g离心15分种只有少量沉淀,取上清到新管后使用磁珠法纯化,nanodrop比qubit依然高30多倍请问100bp前的亮带污染是否为RNA,为什么RNase A法和liCl法都不能有效去除污

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 琼脂糖凝胶相关 510天前
    一般根据凝胶的长度确定电压来防止电流过大造成胶过热,没那么精确的话就120v试试,有过热,电流过大的情况下调电压
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 关于fish探针Tm计算的问题 510天前

    我查到的Tm公式如下,但有几个细节问题,望大牛指导Tm =81.5+16.6logM+41(%G +%C) - 500/ L - 0.62FM =一价阳离子的体积摩尔浓度%XG或C = G和C核苷酸在探针中所占比例L =退火产物的长度F =甲酰胺体积摩尔浓度1 目前网上有说每增加1%(V/V)的甲酰胺可以降低0.72度Tm,这种说法是怎么来的,根据上公式每增加1%甲酰胺Tm变化为   0.62*10*1.134/45=0.156度,(45为分子量,1.134为密度)哪种计算方法对2 由于杂交液中含10%硫酸葡聚糖钠盐,化学式:(C6H7Na3O14S3)n,钠大概占到14%,10%浓度大概是0.6M的钠离子浓度,那其所携带的钠在杂交液中是否也是解离状态

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