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【求助】请问PCR buffer中tris-HCl的浓度应如何选择

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【求助】请问含硫酸铵的溶液能高温高压灭菌吗

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【求助】PCR体系不稳定,无法扩增出500bp以上片段

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  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 IPS细胞计数问题 10天前
    我是需要单细胞时才计,比如电转或者单细胞接种,平时就靠估计,一般6孔80%按1.5*10^6算
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 谁做过iPS核型分析染色体分裂相制备,请指导一下 10天前

    做了很多次了,都滴不出染色体分裂相目前的方案是:覆盖度70%左右加秋水仙素到0.1ug/ml,继续培养3小时撤掉培养基,PBS洗一次,accutase处理6分钟,加2倍pbs终止,吹散细胞200g离心10min,PBS洗一次,离心弃上清8ml  0.075mol KCl 37度低渗30-40分钟加1ml卡诺式固定液预固定,离心去上清8ml固定液固定30分钟,离心去上清8ml固定液固定10分钟,去上清2ml固定液重悬,4度过夜转天滴片,-20玻片放入冰水中,30cm处滴落,火焰上烤制数次结果几次都是找不到染色体,同方案别组做的牙髓间充效果就可以求指导,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 请问哪个公司可以做iPS体外培养的拟胚体的切片染色服务 13天前

    iPS已经在体外形成拟胚体了,目前实验室没有包埋切片设备和染色识别的能力,想做三胚层形态鉴定和特异性染色,哪位同仁外包检测过,给推荐一下,万分感谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 体外转录sgRNA,100ul产量260ug是否正常 48天前
    laib76 不好意思哈,我们是公司做基因编辑服务的,具体的参数不好透露。其实只是想说你这产量并不奇怪,不一定是杂质。当然要我说呢,你的乙醇沉淀有问题,NTP单体很可能会下来的 谢谢回复,我qubit检测一下吧
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 体外转录sgRNA,100ul产量260ug是否正常 48天前
    laib76 一般产量吧,我们一般20uL体系拿到150ug 您也是做sgRNA吗?是短片端产量就这么高吗?你体系中NTP和酶的量是多少呢?谢谢
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 体外转录sgRNA,100ul产量260ug是否正常 48天前

    使用的thermo的T7 RNA聚合酶(EP0111) 100ul体系,2ug线性化质粒,2mM each的NTP,60U的T7聚合酶,37度反应2小时 产物酚氯仿抽提,上清水相加50ul 7.5M 醋酸铵,300ul -20度乙醇,-20度放置2小时,离心弃上清,100ul 70% 乙醇悬浮沉淀,离心弃上清风干到边缘透明,加20ulRNA保存液溶解 nanodrop检测RNA 浓度13000多,260:280=1.97 260:230=2.14 说明书上说产量为50ul大于10ug,根据nanodrop结果产量在10倍以上,2mM NTP理论产量约280ug,反应程度大于90%了,担心是测量值虚高有污染,做过体外转录的战友一般产量是多少,我的方案可能是哪种杂质污染

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  悬赏5丁当求助 95天前

    求一篇文献,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 VEGF121和165哪个适用于EB法向造血干方向分化 185天前

    由于文献只说用VEGF(浓度20ng/ml),没有货号,采购时发现VEGF有很多种,重组的是165和121,哪个更适合造血方向分化,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 VEGF121和165哪个适用于EB法向造血干方向分化 185天前

    由于文献只说用VEGF(浓度20ng/ml),没有货号,采购时发现VEGF有很多种,重组的是165和121,哪个更适合造血方向分化,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求教核酸退火缓冲液的配方 235天前
    不是,我是退火接头连DNA片断或者退火sgRNA的N20连质粒
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 基因合成前的密码子优化问题 235天前

    之前没有做过类似的工作,第一次进行基因合成,对序列使用jcat进行了人的密码子优化和酶切位点排除,加入了cozak序列,但优化后GC%较高,达到67%-68%,很多连续的GC,请问这样的序列会不会影响转录和翻译,还需要用什么软件对序列的结构、GC%等进行优化,或者说GC%高就是对转录翻译有益,麻烦有经验的战友指导一下,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求教核酸退火缓冲液的配方 235天前
    我一般用1X pcr buffer,实际上就是需要一个稳定的PH缓冲和一定的盐离子浓度
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 慢病毒载体做瞬转现实吗? 235天前
    非常感谢您的回复,我还有一个疑问,在电转mRNA的试验中,一般能进入细胞的mRNA会是多少个拷贝呢?考虑到MOI的限制,使用这种设想的方案一次能进入细胞的mRNA理想了估计也是10左后,这样的浓度能否实现功能呢?比如CAS9,谢谢
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 慢病毒载体做瞬转现实吗? 236天前

    能不能去掉5‘LTR,3’LTR和CTTP/CTS,能不能实现正链RNA停留在细胞质内当mRNA用,再去掉POL,另外用的是3代包装质粒是不是RRE也不需要了。

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 PBMC冻存问题 236天前
    右旋糖酐,现在有右旋糖苷:DMSO=1:1的5x防冻液,买来直接用就行
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助伯乐电转仪 电转诱导生成IPS细胞 369天前
    最近也要做电转,cd34+,lonza要等很久,目前只有bio-rad的MXcell,楼主为什么不用脂质体的试剂盒,很多文献都是脂质体转的,我是悬浮细胞效率低没法子
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 有人用过DNase I和锰离子片断化DNA吗? 404天前
    谢谢,用锰离子试着切了效率很低还无法重复,所以直接买了试剂盒。
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  发布了新帖 有人用过DNase I和锰离子片断化DNA吗? 425天前

    想将BAC DNA打断成平末端的DNA片断,DNase I说明书上说锰离子存在条件下可获得平末端,哪位高手用这种方法片断化过DNA,请给一个具体的buffer配方和处理程序,谢谢

  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助BAC DNA 提取污染问题 555天前
    酚氯仿限制使用买不到的,所以只能用磁珠法去除蛋白,异丙醇沉淀后两种检测方法差100倍,加磁珠纯化后比值缩小到30,说明对蛋白的纯化效果还是很好的,但无论liCl还是RNase A都不能把这30的比值去掉,电泳结果显示是RNA污染,liCl,RNase A处理后RNA带还在,比值还是30多.目前只有CTAB法能把比值控制在2以内(改进了qiagen plus系列试剂盒,直接使用试剂盒带的S3比值也是十几),但文献上说CTAB优先沉淀小分子线性DNA,而且回收率一般在20%以下,所以不太敢使用,目前提取质量最好的是阴离子交换柱法,nanodrop检测值和qubit检测值相符,但个位数的回收率实在是太低了.
  • 轩辕顽童
    轩辕顽童  回复了帖子 求助BAC DNA 提取污染问题 555天前
    谢谢您的回复,有几个细节问题还想问一下1,BAC提取中出现这么高浓度的RNA是否正常?我们一次培养500ml菌液,OD2.2左右,按1OD=10^8cfu计算,大概应该有约200ugDNA,实际获得60ml菌体裂解上清液,qubit值为8-12ng/ul,既约600ugDNA,而RNA能达到20-30倍的产量?约1ml OD600=2.2的菌液能获得30-40ug的RNA,这是否正常?还是这些污染物根本不是RNA?2,我之前消化RNA体系过小了,DNA浓度为100ng/ul,RNA约3-4ug/ul,RNase A在100ug/ml浓度下每小时的理论降解能力是多少,我要将RNA稀释到什么浓度范围进行消化处理3.您提到加入100ul 10* buffer3,是不是就是buffer 3,是否要给

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