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  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  发布了新帖 请问药典中Lowry定量蛋白浓度,福林酚试液如何购买和配置? 19天前

    本实验室第一次做Lowry定量蛋白浓度,2015版药典方法描述很详细。就是有一句话看不懂。精密量取对照品溶液0ml、0. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml (对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至1.0ml,再分别加人碱性铜试液1.0ml,摇匀,温放置10分钟,各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1 — 16] 4.0ml,立即混匀,室温放置3 0分钟,照紫外-可见分光光度法(通则0401) ,在650 nm的波长处测定吸光度。这里的福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1 — 16是什么意思?1-16是代码?另外福林试液中的贮备液哪里可以买。谢谢各位战友指导。

  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  发布了新帖 请问药典中Lowry法检测蛋白质浓度的描述中,福林酚试剂如何购买和配置? 19天前

    本实验室第一次做Lowry定量蛋白浓度,2015版药典方法描述很详细。就是有一句话看不懂。精密量取对照品溶液0ml、0. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml (对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至1.0ml,再分别加人碱性铜试液1.0ml,摇匀,温放置10分钟,各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1 — 16] 4.0ml,立即混匀,室温放置3 0分钟,照紫外-可见分光光度法(通则0401) ,在650 nm的波长处测定吸光度。这里的福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1 — 16是什么意思?1-16是代码?另外福林试液中的贮备液哪里可以买。谢谢各位战友指导。

  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 DNA to IND filing in 14 months 74天前
    求问这篇文章,下载学习。另外版主真的好厉害,什么都懂
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 100天前
    老师您好,第一个问题,由于cesds是电进样,我没法具体算到底取了多少蛋白。根据其他老师的说法,在标准方法里面进样时几十ng,我提高蛋白浓度至标准方法的数倍,也就进样200ng不到。和10ug的page上样量相比,还是差50倍。page实验中的杂带是否是前处理反应产生的,有空确实需要研究一下。我也看文章说到高温反应会导致人为杂带的产生,因sds反应肯定要高温抚育才能保证蛋白有效变性。这是不是很难避免了。第二个问题的原因如您所说,已经明确了。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 100天前
    蛋白稳定的,在相关的稳定性实验中,有效期末期的cesds实验才看到一点杂带。您说的100度5分钟煮沸我同事后来做了,还原与非还原的主峰分子量和70度5分钟一样。因此可以确认是其他老师说的,二硫键打开后线性和非线性的原因。还发现100度煮沸5分钟的结果中,杂带多了主峰纯度低于70度5分钟,因此提高反应温度会人为产生杂带。至于原70度5分钟中的杂带是反应产生的。还是原本存在于蛋白中的,还没有研究。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 为什么要当CRC(临床协调员)?-资深HR谈SMO行业的发展 178天前
    因为不了解这个行业,不知道博士进这个行业适合什么职位。本人博士是学医药的,会了解临床的东西,但毕竟不是真的做临床
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 为什么要当CRC(临床协调员)?-资深HR谈SMO行业的发展 184天前
    这种岗位或者行业适合博士入吗
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 单抗类似药细胞株筛选分享 188天前
    楼主,你这个我上次听销售也说过。他客户中有些医院实验室也想做这个,原研药太贵,应该全球第一贵吧。然后说放在CHO根本不表达,我估计和你的问题一样的
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 196天前
    蛋白很稳定,二硫键有很多链内的,十几对吧。打开后不会像单抗那样有亚基。100度我准备试一试。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 196天前
    蛋白二硫键有十几对,都是分子内二硫键,就是打开后也不会像抗体一样形成亚基。100度我准备试试看,谢谢老师
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 196天前
    版主请问一下,写给1%对照品如何理解?浓度上样0.1ug?这样还看得到杂带嘛。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 204天前
    第一个明白了,CE是电进样,进样了多少量我也不知道。也是请教了一个老师和我说,一般都是ng级,SDS-PAGE进样10ug了,加上考马斯亮蓝放大了响应。第二个,非还原和还原与CE一样除了buffer不同,都是70度反应10min。所以都算煮过的吧,从SDS-PAGE看,非还原在还原主峰的位置有浅浅的峰,还原在非还原主峰的位置也有浅浅的峰。这我就很诧异了。以前其他蛋白发现,100度煮沸的杂带比例比70度煮的多,所以我们后来都和CE-SDS一样,用70度反应了。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 204天前
    谢谢版主,这讨论的有点少啊。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 205天前
    jackieustc 我对两种方法的对比讲不好。 但是单独对于SDS-PAGE而言,这个方法做为纯度方法挑战挺大,脱染色细节需要把控,需要考虑灰度扫描是否那么可靠?会影响结果。但确实那个地方是有一些东西的。可能与两种方法检测形式有关。 关于非还原的表观分子量好理解,或许就是不怎么展开,还原后更展开,这个遇到过例子。 版主,你是说二硫键没有完全打开的非还原,sdspage跑的更快嘛。但是cesds两个的保留时间一样,说明分子量是一样的。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 205天前
    各位大神,是否有时做其他蛋白时会发现,CE-SDS和SDS-PAGE的结果不一致,杂带数量不一致,主峰纯度不一致的情况。这个应该如何解释。
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  发布了新帖 请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异 205天前

    CE-SDS和SDS-PAGE都是用于检测蛋白纯度的电泳方法,药典也都有记载,算很常规的操作。但是最近我在做一个蛋白(无糖基化)纯度分析时就发现了这么个问题。还原(红色)和非还原(蓝色)CE-SDS结果见下图,我这里已经把蛋白提高到20 g/L,最终上样的浓度是5 g/L。积分下来纯度都是100%,出峰时间几乎一样。也就是说,还原和非还原分子量一样,而且没看到杂带。下面这个是SDS-PAGE结果,从左到右依次为3个还原操作,Marker,3个非还原操作。点样浓度10ug/孔。胶浓度10%。两个一对比就发现问题了,第一CE-SDS的纯度是100%,是怎么改积分参数都没有其他峰积出来,而SDS-PAGE结果扫描软件就能扫到杂带,非还原有部分聚体,还原有一些低分子量的。第二是SDS-PAGE怎么非

  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 构建IgG1单抗时重链亚型的选择,如G1m1、G1m2、G1m3、G1m17等 228天前
    人鼠嵌合的鼠的意思吧
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 成像毛细管等电聚焦分析技术(iCIEF)检测单抗电荷异质性 528天前
    你好,请问这个文章中。抗体2加了20微升1%TEMED,而抗体1则不用。请问这里20微升1%TEMED起什么作用?什么情况下加这个东西,是怎么考虑的?还请不吝赐教,非常感谢
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 抗体糖型的工艺调节相关文献 529天前
    在ggghhhh大神里看到了,我们实验室写的文章。我帮忙做了里面很多数据。当时师兄还有很多糖代谢的数据,本来可以写着很多代谢动力学数据的,可惜急着毕业要发文章,最后写成了纯工艺优化的文章(加多少什么效果)。   
  • 申花鲨鱼
    申花鲨鱼  回复了帖子 抗体糖型的工艺调节相关文献 529天前
    ggghhhh大神已经发的非常全面了。在增强N-糖基化延伸的添加剂里,ManNAc作为唾液酸的直接前体虽然有效,但是成本太高没人会用的。其他糖类前体添加时,得考察好细胞有没有相应高亲和的转运子,km值多少,这样可以指导添加量。此外很多糖类和葡萄糖是共用转运子的,会影响葡萄糖的代谢,产量细胞代谢都可能受影响,需要充分考虑。BMS作者*********li,也就是ggghhhh发的文章中“Understanding and Controlling Sialylation in a CHO Fc-Fusion Process”这个团队。他们发了很多关于调节融合蛋白糖型的文章,糖皮质激素,IGF之类的,都值得借鉴。抱歉,文献管理不当有点乱,也很忙暂时没时间找。以后正好看到了再上传。

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