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  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  发布了新帖 想做蛋白质和RNA相互作用的EMSA,求问RNA探针的设计要点 9天前

    各位大神,我想做蛋白质和RNA相互作用的EMSA,但周围没人做过,木有底气,想问问RNA探针的设计要点,预料中的蛋白质和RNA结合的目的序列大概8bp那样子,那我的探针需要设计多长合适,需要体外转录长的,还是找公司合成不用那么长的

  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 有没大神做过RIP实验,求指教呀呀呀,然后有没推荐的RIP试剂盒 9天前
    做第四遍了,第三遍感觉有一丢丢成功的趋势,准备再整整
  • 爽朗的赖赖赖
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  发布了新帖 最近用6his标签纯化试剂盒纯化我的重组蛋白,发现有杂带,求指教 36天前

    各位大神,我最近用6his标签纯化试剂盒纯化我的重组蛋白后发现除了我要的蛋白外还有杂带,而且比较单一,变性跑的蛋白质,如果说纯化没洗干净的话应该很多条带,暂不考虑,可能是二聚体没整干净,也可能是之前和这个蛋白相结合的其他蛋白给一块整下来?想不懂,各位大神知道这是啥情况么,怎么去掉它呢,我想用30kD超滤管不知道能不能去掉,不过我这个蛋白纯化是要有活性的,它本来就可能是二聚体啥存在,超滤管会不会把它也给清了?

  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 有没大神做过RIP实验,求指教呀呀呀,然后有没推荐的RIP试剂盒 36天前
    一塌糊涂,Millipore的试剂盒是做细胞的,我整细菌,试剂盒的裂解液裂解都裂不掉,想方设法中。
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  发布了新帖 求问细菌做westernblot用啥内参合适? 143天前

    近期要做个westernblot,就是做细菌的,看资料说要有内参比较好发文章,但是网上找一下好多内参抗体说明那都没提到细菌,就怕不能用在细菌上,**各位大神有啥推荐的

  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 有没大神做过RIP实验,求指教呀呀呀,然后有没推荐的RIP试剂盒 143天前
    在你没回复之前我找来找去就找到Millipore的试剂盒,最近刚刚到货,贵得很,不知道能不能成要不然早看到你的回复的话我就可以对比对比了
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  发布了新帖 有没大神做过RIP实验,求指教呀呀呀,然后有没推荐的RIP试剂盒 186天前

    不久后要做RIP实验,有没做过的大神来指教一下呀,首先我准备买试剂盒做,就是RIP(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit)试剂盒,各位大神有什么推荐的试剂盒么,我问来问去,没问出啥,就来这请教各位大神啦,然后这个实验有没特别需要注意的地方呢?谢谢!,

  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 引物设计碰到麻烦呀 292天前
    谢谢大神,哈哈,那我先自己试一试,实在不行再找找公司帮忙设计
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 引物设计碰到麻烦呀 292天前
    谢谢大神,那我先自己试一试啦
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 引物设计碰到麻烦呀 294天前
    谢谢大神,不过,我问实验室师姐,实验室引物一般在华大基因那搞的,说没有帮忙设计的我又不知道其他哪些能帮忙设计的,于是,这几天找了些引物设计的资料看了看,然后把目的片段两端放宽些,找到primer软件评价接近八十分的准备搞来试一试,不知道能成不,不过还有一个问题,我是准备扩增之后酶切的,扩增片段上游有个本来就有的酶切位点,下游没有,我就准备引物上加上酶切位点,然后这个引物的tm是按照加酶切位点前算还是按加后的算,还是说pcr时先按没加时算之后再按加后算大神你知道不
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 primer premier 6.00 安装与激活 299天前
    哈哈,要用管理员运行,可以直接在c盘搜索cmd.exe这个,然后右击以管理员运行,再搞
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 引物设计碰到麻烦呀 300天前
    哈哈,谢谢大神,还有这种操作的呀,我还不知道,哈哈哈哈
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  发布了新帖 引物设计碰到麻烦呀 300天前

    各位大神,我实验要copy个基因,用来做表达载体的,因此这个扩增片段是明确而且不能乱改的,因此我引物就只能是它两端那,可是软件说这引物有二聚体,错配,发夹结构,呀呀呀,看得我心里好没底,引物二聚体我可以再提纯,错配听说用高保真酶能控制少一些,但是发夹这个我不知道咋处理,这个发夹是软件说有还是看几率,通过什么来判断几率,碰到我这种情况该如何解决呢,我想来想去,搞不懂因此来请教大家。

  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 求pWH1266质粒的相关信息 305天前
    谢谢大神,太感谢你了,这个mRNA反转录也是原来的设想,并没做,而且当初设想也只是按cds做引物copy而已,因为cDNA序列我也不知道,能知道有的序列也只是cds,现在想想没啥必要,这个原核生物基因没有内含子,也没必要从cDNA入手了,至于这个菌的启动子,NCBI里头有这个菌的序列,但是各个基因都没说启动子,这个鲍曼不动杆菌可能信息太少了,我前几天用NCBI看pbr322质粒序列它就有写启动子在哪之类的,这种就很清晰,看这个鲍曼的序列就只有说哪里是cds,想想也只能硬着头皮这么做了,谢谢大神的指导,刚开始搞实验方案就这么头大,接下来四处收集物资,然后做实验等希望能顺利些,再次谢谢大神
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 求pWH1266质粒的相关信息 305天前
    哈哈,谢谢大神,这篇文章我看过,它的基因是整一个完整的,比较好办但是我这个基因在NCBI里头找不到完整的,它写的gene和cds一样的序列没有前面的启动子,sd序列,也没后面的终止子,我又不确定哪段是,因此才想把它先前那个蛋白之后的序列到这个基因这整一段都copy下来(这两者之间应该就包括启动子,sd序列了),尾巴的话怕带上后面基因启动子就到终止密码子那就好了,用这样一段替换掉质粒原有蛋白前大半部分序列,后面部分原有蛋白没sd段也表达不了(应该没啥影响),后面接上质粒原来的终止子,嗯,想法就是这样,就是不知道可行不想来想去好像也只能这么搞了,接下来先找找物资啥的
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 求pWH1266质粒的相关信息 306天前
    哈哈,大神,今天早上我又想到一个想法了,就是把目的基因片段上游基因末端那开始到我要的基因整一块都插进载体里头,不知道可行不,但是昨天用那个启动子预测网没预测出那里有启动子,而是预测在目的基因上游那个基因前面有可能有启动子,考虑到可能这原核细胞两个蛋白共用一个mRNA的可能,但是两个蛋白隔了250多bp,想想可能性也不大,哎,越想越复杂,是不是我想太多了,大神你有了解有啥其他办法预测一下启动子、sd序列啥的么
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 构建个原核表达载体反转录cDNA扩增后,直接酶切和表达载体连接咋样 306天前
    谢谢大神,我做鲍曼的表达载体,想看这蛋白功能的,融合蛋白找不到适合的,融合多怕影响功能,非融合的话,我又找不到这个基因的启动子,想了很多方法,想到个想法,想把上游上一个基因末端到我要的基因这一段都插进载体里头,这样应该就包括启动子和sd序列了吧,不知道是不是有这样的做法,大神你有了解么。
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  回复了帖子 求pWH1266质粒的相关信息 306天前
    谢谢大神,真是太感谢大神了我最近才用这个论坛的,还不知道有引用这个,哈哈,我最近查好多质粒,有些质粒做融合可以控制8个aa,可是我做鲍曼不动杆菌,这些质粒不适用,能用的太少了,pwh1266融合的话最少是加35aa,我蛋白才80多aa,加上去怕功能发挥不了,其它鲍曼能用的质粒都找了一遍,没有合适做融合蛋白的,还查看一种切到质粒蛋白之前位点,然后用pcr时修饰把多切的补上的,可是这些质粒能切的都太远,这个方法也不行,这个鲍曼基因NCBI里头也没找到启动子在哪,听百度的用Promoter 2.0 Prediction Server网站预测一下,说176300那有启动子(我目的基因起点在176941感觉好远,不知道靠谱不),但是这个是启动子的起点还是终点呀,没看懂大神你有了解么,然后如果是的话是不
  • 爽朗的赖赖赖
    爽朗的赖赖赖  : 有认证,有身份。我是医生,我通过了丁香园认证,拥有了专属身份标识和查看病例帖的特权,还得到了 30 丁当的奖励。你是医务工作者吗?一起来认证吧,首次通过丁香园认证还能免费获得 6 个月用药助手专业版会员http://dxy.me/MNZna2

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