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【求助】看看我们制作的stbl3感受态

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【交流】再谈EB的危险性

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【讨论】为什么中药越来越衰败

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  • 天猫
    天猫  回复了帖子 荧光引物跑毛细管电泳在固定位置有杂峰 381天前
    dxy_i9r0ke67网友你好。根据你描述的情况看,所有的检测样品中都在相同位置出现了相同的杂峰,而且这些杂峰在没有进行扩增之前就已经产生了,表明杂峰不是由PCR反应产生的。由此推测,杂峰产生的最大可能性是PCR引物合成的过程中引入的。建议合成引物时选用比较好的手段对引物进行纯化,比如说用高效液相色谱的方法进行纯化。当然也可能是由于引物保存、使用不当而产生的杂峰,例如荧光染料脱落导致的染料脱落峰等。再者有可能是检测仪器或者检测试剂污染导致的。甚至还有其它原因。你需要逐一排查。
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 631天前

    回复:【求助】SSR毛细管电泳有效特异峰型的判定

    感谢lijiangwei0310网友点将,这的确是我碰到的最糟糕的情形之一,硬着头头皮说一下吧,希望对你有所帮助。先说最简单的,最后一张图应该能应用,没有什么问题,只不过你可能在PCR循环结束后,72℃保温的时间不够长,导致大部分扩增片段都没有添加额外的A碱基,从而产生了分裂峰。...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 看看我们制作的stbl3感受态 865天前
    Inoue法制备感受态细胞并不适用于所有大肠杆菌菌株,具体可参考《分子克隆3》的相关描述
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 1093天前

    回复:【求助】STR 毛细管电泳特异峰分析

    @du3703980你提供的这4幅图杂峰实在太多了,令人头皮发麻!首先需要解决+A不全的问题,我看来一下,基本上大部分峰之间的间隔都只有1bp,说明存在严重的+A不全的问题。可以延长PCR循环最后的72℃保温的时间至40分钟,然后在上机检测。解决+A不全的问题后,再才能考虑判别主...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 STR 毛细管电泳特异峰分析 1094天前
    @du3703980你提供的这4幅图杂峰实在太多了,令人头皮发麻!首先需要解决+A不全的问题,我看来一下,基本上大部分峰之间的间隔都只有1bp,说明存在严重的+A不全的问题。可以延长PCR循环最后的72℃保温的时间至40分钟,然后在上机检测。解决+A不全的问题后,再才能考虑判别主峰与stutter峰的问题。准确排除stutter峰也需要排除+A不全的干扰。祝好运!
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 1105天前

    回复:【求助】STR 毛细管电泳特异峰分析

    jared85 @天猫  从头看到尾,这真是收益颇丰的帖子。自己做过一些分型工作,总体感觉SSR毛细管分型依然存在诸多问题,尤其对于大样本的分型,单单读带工作就有些吃不消。最近在考虑 能否通过高通量测序完成SSR的分型,您有何建议?能否减少分型工作量以及提高准...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 STR 毛细管电泳特异峰分析 1105天前
    jared85网友你好!我没有试过用高通量测序的方法进行SSR分型,但根据我对二带测序技术的了解,可以考虑针对 不同的SSR标记扩增引物分别添加不同的tag序列的方法,从而可以将不同的SSR标记的扩增产物混合在一起,甚至可以将不同物种、不同个体的不同SSR标记扩增产物混合在一起,从而便于利用二代测序技术对所研究的标记进行分型。由于我主要用多种荧光分别标记对不同SSR位点,然后用multiplex PCR的方法进行扩增,一般情况下都能搞定SSR的分型,所有暂时并未考虑用高通量测序的方法进行SSR分型。以上建议纯粹是从SSR分型和二代侧序的技术原理出发而提出的,理论上应该是可行的,但我并无这方面的实际经验,仅供参考。
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 1155天前

    回复:【求助】STR 毛细管电泳特异峰分析

    @godlikexp 网友你好!我大致浏览了一下你发的图谱,感觉问题比较多。简要回复如下,仅供参考。1、有些位点的杂峰实在太多,杂峰的成因也比较复杂。例如第一个图,131/137/148/155等等虽然被分析软件标记为主峰,但并不见得这些峰都是真正的主峰。加之许多低矮的...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 STR 毛细管电泳特异峰分析 1155天前
    @godlikexp 网友你好!我大致浏览了一下你发的图谱,感觉问题比较多。简要回复如下,仅供参考。1、有些位点的杂峰实在太多,杂峰的成因也比较复杂。例如第一个图,131/137/148/155等等虽然被分析软件标记为主峰,但并不见得这些峰都是真正的主峰。加之许多低矮的、未被标记的杂峰,因此,判断哪些是真正的主峰,哪些是杂峰是一件非常困难的事情。建议:1)重新设计引物,减少杂峰干扰;2)优化扩增条件,减少非特异性扩增产物;3)与检测的工程师沟通一下,看有没有仪器光谱校正方面的原因。2、是主峰还是杂峰,除了峰高指标外,还要结合引物进行分析。一般在设计引物时,软件会自动给出目标产物的片段大小,而这个大小应该是判断主峰的一个重要依据,因为理论上说,主峰就因该出现在这个位置附近。3、我上次
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 1164天前

    回复:【求助】STR 毛细管电泳特异峰分析

    godlikexp @天猫  老师您好,  如图,二倍体生物   两碱基重复,这样的图太多了,求指教你好!两碱基SSR扩出这样的结果应该算是比较好的,主峰判断也是准确的,可参考我以前的内容。图谱可以分成前后两部分,这是由非特异性扩增导致的,...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 STR 毛细管电泳特异峰分析 1164天前
    你好!两碱基SSR扩出这样的结果应该算是比较好的,主峰判断也是准确的,可参考我以前的内容。图谱可以分成前后两部分,这是由非特异性扩增导致的,你可以只看峰高较高的部分,将其作为分型的依据。本例中右边峰高较矮部分应该是非特异性扩增的产物,它的峰形特点总体来说与正常扩增的部分有一点镜像关系。
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 IAA详细的配制方法及注意事项 1206天前
    很简单。称50 mg IAA,先用少量 1 M的NaOH溶解,再用水定容至100 ml即成浓度为0.5 mg/ml的储存液
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 1208天前

    回复:SSR毛细管电泳结果怎么读条带,用什么软件?

    1、SSR就是STR,同物异名,因此,处理STR的软件理论上也能处理SSR2、743和050的主峰明显,判读应该是正确的,但其余的位点特异性较差,且有较严重的stutter峰干扰,较难判读。建议先做一下扩增的优化,看能不能改善。推荐的优化方案包括touchdown、梯度、适当提高...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 SSR毛细管电泳结果怎么读条带,用什么软件? 1208天前
    1、SSR就是STR,同物异名,因此,处理STR的软件理论上也能处理SSR2、743和050的主峰明显,判读应该是正确的,但其余的位点特异性较差,且有较严重的stutter峰干扰,较难判读。建议先做一下扩增的优化,看能不能改善。推荐的优化方案包括touchdown、梯度、适当提高引物复性的严谨度等。如果仍然不能改善的话,估计只能重新设计引物了。3、主峰判读是否正确,除了峰型本身比较清爽外,还要结合理论预测进行判读。正常情况下,主峰不应该偏离理论预测的位置太远。由于不同仪器、不同染料标记,主峰偏离理论预测的位置±2~5bp应该是可以接受的。4、请参见我以前的答疑帖:【求助】STR 毛细管电泳特异峰分析 [精华]  http://dxy.me/rIJVRj
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 韩春雨发现的新DNA编辑技术--NgAgo编辑技术已经在手机上刷爆了 1290天前
    NgAgo技术非常厉害,将对人类社会产生深远的影响。关键是,这一技术是被我国本土科学家在国内取得的、具完全知识产权的技术。本想写一篇科普短文介绍这个技术的,但由于该技术实在太给力了(我称之为“上帝之手”),而自己的学识有限,把握不了该技术将会对科学(生物学、医学、大农业科学,等等)、社会、宗教、心理学,甚至艺术等等方方面面产生怎样的影响。打一个比方,好莱坞拍过许多科幻大片,如超人、蜘蛛侠等等电影。这些电影都有一个虚构的科幻情节:用注射器向人体注射一下就可将一个凡人变成具有超能力的人。有了韩春雨的这个技术,上述科幻情节将有可能梦想成真了!由此可以窥见,该技术具有何等的威力!
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 韩春雨发现的新DNA编辑技术--NgAgo编辑技术已经在手机上刷爆了 1291天前
    限制性内切酶的发现推动了分子生物学的研究和基因工程的诞生与应用,极大地改变了我们的生活。但这些技术远远没有达到对遗传物质进行精准、定向编辑的程度;DNA的定向诱变技术的发现在一定程度上实现了之一目标,但操作起来限制太多。以上两个技术的发现,取得了大批诺贝尔奖级别的成果,也成就了大批高新技术公司,创造了大量财富神话。如今,韩春雨老师的这个发现的意义实在太重大了。与锌指结构蛋白介导的DNA编辑技术和cas9-RNA介导的DNA编辑技术相比,韩春雨老师发现的这个NgAgo编辑工具/技术简直就是一把无比精确又所向霹雳的工具。有了NgAgo编辑工具,人类就如同获得了对遗传物质进行精准、定向编辑的“上帝之手”!这是多少从事分子生物学研究的科技工作者梦寐以求的呀!想想前不久有传闻,说美国政府已经通过了决议
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 1300天前

    回复:【求助】STR 毛细管电泳特异峰分析

    bj24t 请教@天猫 大大taq酶加A尾,那读数的时候,我们自己需不需要减掉1个bp呢? (若加A很完全的话)因为文献上给的参考片段大小,应该是没有加A的时候吧?谢谢您如果只做多样性分析,且加A完全的话,可以直接应用+A的数据。标明即可,不必扣除。由于Taq酶+A处理...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 STR 毛细管电泳特异峰分析 1301天前
    如果只做多样性分析,且加A完全的话,可以直接应用+A的数据。标明即可,不必扣除。由于Taq酶+A处理更容易些,而令扩增片段不加A则相对比较困难,现在进行SSR多样性分析时都是直接应用+A后的数据,即便是人类的SSR分析都是如此。如果是进行序列研究就另论了。
  • 天猫
    天猫  的帖子被加了1分 1307天前

    回复:【求助】STR 毛细管电泳特异峰分析

    jiaclub @天猫 老师您好,如果我研究的对象是单倍体(藻类),但是在其生活史中存在孢子体和配子体,即是存在2倍体,但是由于其形态和单倍体完全一样,因此无法区分,所以我送了公司后,部分引物的峰图很漂亮,都是单峰,但是部分引物是双峰。这样的话我该如何选择呢。 jiac...
  • 天猫
    天猫  回复了帖子 STR 毛细管电泳特异峰分析 1307天前
    jiaclub网友你好!不知你研究的藻是大型藻还是单细胞的微型藻类。如果是大型藻类的话,就可进行单个个体的检测。在这种情况下,如果出现了双峰,在排除了引物扩增的非特异性问题后,可以判断该个体是2n(二倍体)。针对某个具体的个体而言,即便部分引物是单峰,只要有另一些引物出现了可靠的双峰,也表明这个个体是2n的,因为单峰只是表明了这些位点是纯合子。但反过来说,如果所有位点都是单峰,也不能排除2n的情况,因为给个体可能是一个纯合基因型的个体。这在自交繁殖的情况下是常见的。如果是单细胞的微型藻类的话,则要考虑扩增的群体是否来源于单细胞个体。如果本来就是一个混合群体,则有可能出现一些引物是单峰,一些引物是双峰,甚至多峰的情况。

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