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丁香客

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  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 慢病毒过表达后WB结果异常,**分析 18天前
    你说的这种情况,我没碰到。但也是有可能的,常见的原因之一是该基因表达多种mRNA序列,而构建的是腺病毒只是其中之一,且不是编码区最长的那一个,就有可能出现你说的这种情况;当然,也有可能是其它原因导致的。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 hyclone的胎牛血清怎么样?我准备做H9c2心肌细胞培养 42天前
    我之前用Gibco的血清,后来换用HyClone的南美胎牛血清SV30160.03,用了2年多了,一直挺好。至于你说到不干净,不知道是不是指会出现沉淀,我也碰到过,原因也找到了,解冻血清时保持轻微晃动,就不会出现沉淀,反之静止状态下解冻,易出现沉淀。HyClone南美血清不贵啊,每瓶500ml的价格在两千以下,跟国产血清价格差不多,但质量比Gibco南美血清的都要更好一些。不同代理商报价差太大,我还看到代理商报价3千以上的,太暴利了
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 我太难了....养不好细胞了 155天前
    这么比较一下,我之前的导师应该是观世音下凡
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 现在大家用的是哪个厂家的血清 159天前
    Yoda1985 半山烟雨 3000人民币能买到Gibco北美血清16000-044?真货的话,不可能。市面上Gibco南美血清都卖到了两千多 Gibco北美产地的血清并不是只有一种货号,不同货号价格是有差异的,比如加拿大产地的北美血清现在就三千出头,去年三千买到很正常,并不一定是假的。 你这么说是没问题的,我说的是“Gibco北美血清16000-044”,这个3000多元的不可能是正品。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  的帖子被加了1分 160天前

    回复:现在大家用的是哪个厂家的血清

    之前用Gibco的南美血清10270-106现在改用Hyclone的南美血清SV30160.03之所以把一些关键信息抹掉,是担心不良奸商根据这个去造假。Gibco的南美血清还是可以的,常规细胞培养都能满足,但相比之下,Hyclone的南美血清SV30160.03的质量更好,培养原...
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 慢病毒包装问题求助(有图) 161天前
    想做到感染效率完全一样可不容易,最好是用药物筛稳转细胞系,那就都是100%的感染表达。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 293T,包病毒 161天前
    lxn90219 半山烟雨     48h,72h,96h都试过,都能收集到病毒,至于哪个滴度最高,就没有比较过;是用来感染细胞构建稳转细胞系,都能做出来。 产毒对293T状态影响很大,48小时产毒量应该是比较大的,而细胞还不至于大部分或几乎全部飘起来。时间越往后,漂浮的细胞越多,裂解的细胞也越多。 293包病毒后形态发生变化吗?会裂解吗?谢谢这位战友 293T细胞会停止增殖,细胞状态会显著变差,能看到颗粒样漂浮物(可能是部分细胞裂解),细胞内也可能看到颗粒状物质,到后期细胞大部分会死亡漂浮。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 人基因组DNA提取出来为什么是一条带的? 219天前
    染色体太长,超过了胶的有效分辨范围,50万、100万、200万bp的以及更大的,跑出来都是一条带。
  • 半山烟雨
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 如何保证目的基因插入载体后不发生移码突变 242天前
    主要是插入片段的N端会融合载体本身翻译的部分序列,也就是说翻译起始序列ATG在载体上,你得确保从这个ATG翻译到你的目的序列时,目的序列是按照预期的密码子在翻译,若多或少一个或两个碱基,就会移码。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 LO2细胞 284天前
    这个细胞很好养,前段时间一直在养。我用MEM加10% HyClone南美胎牛血清SV30160.03,就能长得很好,增殖很快。HyClone南美血清才一千多,价格可能还不到Gibco澳胎的三分之一。若实验室不在乎钱,直接买最贵的就是。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 293T,包病毒 290天前
    48h,72h,96h都试过,都能收集到病毒,至于哪个滴度最高,就没有比较过;是用来感染细胞构建稳转细胞系,都能做出来。产毒对293T状态影响很大,48小时产毒量应该是比较大的,而细胞还不至于大部分或几乎全部飘起来。时间越往后,漂浮的细胞越多,裂解的细胞也越多。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 稳转慢病毒感染细胞,药筛一次 48小时后,后面可以直接用细胞吗? 294天前
    药筛48小时,比较短,除非阴性对照(未感染病毒的培养瓶或培养皿)细胞全死了,否则可能筛选时间不够。不同的筛选药物,时间可能不同。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 慢病毒包装污染问题 294天前
    有荧光,说明转染是成功了。你可以试试不加包装质粒,只转染目的基因质粒,应该也能看到荧光。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  的帖子被加了1分 296天前

    回复:敲除某个基因可以抑制细胞凋亡,转染该基因shRNA,发现细胞状态确实很好

    1139579 比如说A基因过表达可以诱导凋亡,而其shRNA可抑制凋亡。之前转染A基因过表达质粒后,转染了两三次,发现转染后细胞状态都不好,那时候想可能是因为脂质体毒性引起的。前几天又用其shRNA转染细胞,发现细胞状态都很好,觉得很奇怪,感觉是不是shRNA起作用引起的,大家...
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 敲除某个基因可以抑制细胞凋亡,转染该基因shRNA,发现细胞状态确实很好 296天前
    脂质体本就对细胞的影响较大,对敏感娇嫩细胞影响更大。转染后两三天,看细胞状态能不能恢复。其它转染试剂也会有或大或小的影响。但是也不用太担心这些,你的实验做好对照就行。一定要有严格的对照组,否则结果就是垃圾、没有意义。shRNA除了了有shcontrol做对照之外,严谨些的一般要有两个靶点shRNA。最好在蛋白水平验证确实有显著降低,若没有抗体,得在mRNA水平验证knockdown效率。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 怎么让基因在特定组织表达 296天前
    用特定的启动子。人类有数万个基因,有些基因是在所有或大多数组织中表达,而另外一些基因只在特定组织表达,只在特定组织中表达的基因的启动子可以为你所用,将它替换掉你目的基因原有的启动子,或将它与目的基因连在一起,导入胚胎,通过繁殖筛选得到纯合子,所有组织细胞基因型都一样,但目的基因却只在特定组织表达。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 慢病毒哪家不错 296天前
    自己的实验时不时就用到慢病毒过表达和knockdown,自己构建过表达质粒和shRNA质粒,最近会做,可以顺便给带上。我这是用来做稳转细胞系的,你若是用慢病毒做稳转细胞系,可以联系我;你若是用来打动物,那个量太大,就不用联系了。
  • 半山烟雨
    半山烟雨  的帖子被加了1分 297天前

    回复:正常细胞WB靶蛋白有表达,肿瘤细胞WB未检测到,敲低实验后却有明显功能学差

    成长的小医生 最近研究一个蛋白在**肿瘤中的意义,发现几种肿瘤细胞中都不表达,正常细胞有表达。暂时没有做过表达实验,做了敲低实验后,PCR验证明显敲低,WB都测不出。但是后来的功能实验(克隆、CCK-8、周期、凋亡)都有差异,这样的实验有意义吗?"PCR验证明显敲低,WB都测不出...
  • 半山烟雨
    半山烟雨  回复了帖子 正常细胞WB靶蛋白有表达,肿瘤细胞WB未检测到,敲低实验后却有明显功能学差异。。 297天前
    "PCR验证明显敲低,WB都测不出"在正常细胞做的?敲低效果极佳时,WB做不出来也是正常现象,我就遇到过。做敲低实验,选表达相对较高的细胞做,最好是做两个不同靶点的敲低,功能实验的变化一致。做过表达,选内源性表达低的细胞来做,一般来说,这样更容易得到想要的功能实验结果。

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