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  • 为科研实验而生
    为科研实验而生  回复了帖子 蛋白在浓缩胶里弥散是怎么回事? 23小时前
    可能是抗体浓度太高,或者封闭时间太长,建议缩短曝光时间,减少上样浓度
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    为科研实验而生  回复了帖子 蛋白质实验 2天前
     可能是TEMED加少了,这个要看天气情况加的
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    为科研实验而生  发布了新帖 MTT实验前注意事项及贴壁细胞/悬浮细胞实验大汇总 241天前

    实验前应明确的问题  1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行mtt 试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。  2. 药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。  3. 时间点的设定。在不同时间点的测定O

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    为科研实验而生  发布了新帖 几种基本蛋白质浓度测定方法比较(三)-评价 312天前

    1.紫外法:   紫外分光光度法是以紫外光为光源、波段在180~360nm的分光光度法。基本原理及仪器构造与分光光度法类同。主要用于有机化合物鉴定及结构分析,对具有π键电子及共轭双键化合物特别灵敏,还可对同分异构体进行鉴别。无机分析多用于定量测定。   可以利用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,服从朗伯-比耳定律,因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。   最常用的紫外吸收法是280 nm的光吸收法,含

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    为科研实验而生  发布了新帖 心肌炎模型小鼠(白喉毒素感染)(DMY45Mu02) 315天前

    产品货号   DMY45Mu02推荐分类   心血管系统疾病动物模型   本源物种造模动物   小鼠(Mouse)动物品系   BALB/c小鼠复制方法   体重为25?30g的实验小鼠,先对实验动物观察3d,选择健康动物进行造模,造模方法为将白喉毒素原液,按7.30 μl/g体重的剂量经小鼠尾静脉注射。注射后30 min,待白喉毒素基本吸收后再注药。观察指标包括: ①体温,实验前2d开始测量肛温,给白喉毒素后每24 h测 4次,直至死亡。②呼吸与—般活动状态及食量情况每6 h 作一次记录。③心电图,实验前2d开始

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    为科研实验而生  发布了新帖 PCR-SSCP实验原理及步骤 317天前

    实验原理 聚合酶链式反应-单链构象多态(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism,pcr-SSCP)技术是在PCR技术基础上发展起来的,它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变(点突变)的手段。该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的筛查检测,遗传病的致病基因分析和基因诊断,基因制图等领域。    在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)被变性成为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象,即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性

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    为科研实验而生  发布了新帖 专业蛋白质westernblot检测的详细方法 318天前

    WESTERN BLOT   ①将蛋白电泳后的凝胶浸入电转缓冲液中15min。   ②将电转膜(醋酸纤维素膜)先在甲醇中浸泡至完全湿润(甲醇用于活化电转膜上的基团,可能是使得膜上的正电性增强),然后再将膜浸入超纯水中5min,最后再将膜浸入电转液中15min。   ③滤纸先在电转液中完全浸湿,然后将滤纸平铺在电转纤维上,在滤纸正上方平铺凝胶,在凝胶正上方平铺电转膜,在电转膜正上方平铺滤纸,最后用玻棒赶气泡。(注:滤纸一定要比电转膜略小,也可比凝胶略小,最好与凝胶大小一致;电转膜应与凝胶大小一致或略大;理论上,电转膜的大小只要能够覆盖住目标区域即可)。   ④100V,电转1

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    为科研实验而生  发布了新帖 几种基本蛋白质浓度测定方法之比较 325天前

    1. 蛋白质定量测定方法的基本原理(1) 紫外分光光度法   蛋白质分子终中所含的酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸残疾的芳香族结构对紫外光有吸收作用。其最大吸收峰在280nm 附近。当蛋白质的质量浓度在0.1~1.0g/L之间时,其紫外吸收值与浓度成正比,可用作蛋白质定量测定。(2) 双缩脲法   蛋白质含有多个肽键,可发生双缩脲反应,在碱性溶液中,蛋白质与铜离子形成紫红色络合物,可在540nm比色测定。当蛋白质的质量浓度在1.0~10.0g/L之间时,其颜色深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质相对分子质量及氨基酸组成无关。(3) Folin-酚试剂法   这种方法是对双缩脲法的发展。蛋白质与碱性铜溶

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    为科研实验而生  发布了新帖 生物发光胰腺癌细胞-用于活体成像实验 326天前

    BxPC3-luc人胰腺癌一细胞名称   BxPC3-luc二、组织  人胰腺癌细胞三、母细胞来源  ATCC四、 标记过程的描述 慢病毒转染,GFP筛选。(一)慢病毒包装部分   1. 质粒共转染细胞:转染前一天,293FT在10cm培养盘中的细胞达到90%,胰酶消化后,1:3传入新10cm培养盘中。转染时,细胞在培养盘中密度达到80%。采用脂质体PEI转染法使编码慢病毒包膜蛋白的质粒VSV G, Packaging Mix以及构建的pSLV-CMV-luciferase-GFP质粒15μg共转染。6h后换新鲜DMEM培养基。   2.提取病毒上清:转染48-72hours后,将含有病毒液的

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    为科研实验而生  发布了新帖 免疫胶体金稀释液的配伍原则 330天前

    免疫胶体金稀释液的配伍原则   制备好免疫胶体金后,还需要将其稀释到一定浓度,并吸附于特殊的惰性介质中才能够最终制成产品。一般来说,特殊的介质常用的是玻璃纤维或无纺布。玻璃纤维和无纺布本身一般是疏水的,胶体金产业一般采用表面活性剂预处理过的玻璃纤维或无纺布,通常配方为1%Tween20+适量PVA。介质处理完成后,免疫胶体金稀释液的配伍才是最关键的。现总结原则如下,不足之处欢迎批评或补充。1 合适的离子种类和强度   免疫胶体金毕竟是含有生物活性分子,应用时还要面对千差万别的样品,原则上需要稀释在合适pH的缓冲液中。经验值是6-9。在这个范围内可选的缓冲主要有tris和PB,也不排除其他种类缓冲适用的可能。当使用的缓冲离子强度过大如

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    为科研实验而生  发布了新帖 初学者对于蛋白纯化的几点体会 332天前

    近来刚接触蛋白纯化的实验,对于研究本来就不多的我来说,这样的实验算是一头雾水。在不断求知,不断实验,不断看书的过程中,现在有几点体会,求大神们来围观指点。   先说明一下我现在的实验,是一个有活性的酶,孢内酶,等电点4~5左右,所以使用弱碱性的阴离子树脂进行纯化。   对于大体方向的实验步骤,实验书籍中都有介绍,无非是确定树脂的类型,确定洗脱剂以及缓冲溶液的pH。这样再进行洗脱剂浓度的测定。   但是在细节方面,我感觉有更多的疑问,致使像我这样的初学者不能进行实验,更为重要的是在遇到困难时如何取解决问题,这是最为重要的。   好了,现在就开始进行我的体会之旅吧。 

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    为科研实验而生  发布了新帖 常用细胞凋亡检测方法 333天前

    细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 (1) 未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 (2) 染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33

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    为科研实验而生  发布了新帖 ELISA、WB、Q-PCR采样及取样注意事项 337天前

    ELISA取样及运输注意事项一、血清提取方法:   1.全血促凝管取血,轻轻颠倒两三次,放置片刻让全血凝固,凝固后3000转15-30min离心取上清。   2.全血普通EP管取血,室温放置2h左右,让其凝固,凝固后3000转15-30min离心取上清。   特别注意:取血清避免震荡,以防止溶血,溶血会对结果有影响。二、样本取量及运输   每个指标做单孔检测,一个样本需取血清30ul,3个复孔需90 ul,冰盒-20度中短时运输(小鼠建议采取摘眼球取血,如果血样有限在试验方案允许的前提下可以取多只小鼠血样混合)。三、样本编号   样本标号:&n

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    为科研实验而生  发布了新帖 细胞化学染色法 339天前

    实验原理    1. 细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后,其中的 DNA 和 RNA 出现不同的呈色反应,一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力,且这两种染料的作用有选择性,甲基绿染高聚分子的 DNA 呈蓝绿色,呱咯宁染低聚分子的 RNA 呈红色。由此对细胞中的 DNA 和 RNA 进行定位、定性、和定量分析。    2. 由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同,在 pH 值不同的溶液中,蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下,整个蛋白质所带负电荷多,则为酸性蛋白质;带正电荷多,则为碱性蛋白质。据此,可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后,用不同 pH 值的固绿染液分别染色

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    为科研实验而生  发布了新帖 几种核酸提取方法概述 340天前

    (1).浓盐法    利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.    两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.    以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提

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    为科研实验而生  发布了新帖 MTT 实验 345天前

    实验前应明确的问题   1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。   2. 药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。   3.

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    为科研实验而生  发布了新帖 ELISA、WB、Q-PCR采样及取样注意事项 346天前

    ELISA取样及运输注意事项一、血清提取方法:   1.全血促凝管取血,轻轻颠倒两三次,放置片刻让全血凝固,凝固后3000转15-30min离心取上清。   2.全血普通EP管取血,室温放置2h左右,让其凝固,凝固后3000转15-30min离心取上清。   特别注意:取血清避免震荡,以防止溶血,溶血会对结果有影响。二、样本取量及运输   每个指标做单孔检测,一个样本需取血清30ul,3个复孔需90 ul,冰盒-20度中短时运输(小鼠建议采取摘眼球取血,如果血样有限在试验方案允许的前提下可以取多只小鼠血样混合)。三、样本编号   样本标号:&n

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    为科研实验而生  发布了新帖 分子诊断实验方法 347天前

    生物大分子主要指核酸(DNA和RNA)和蛋白质,通过从分子水平上完成DNA, RNA或蛋白质检测,从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断,目前常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测两种。 基因诊断   基因诊断是用分子生物学的理论和技术,通过直接探查基因的存在状态或缺陷,从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能,从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。 人体基因组的类型早在受精卵开始时就已形成,因此在人体发育的任何时期,只要获得受检者的基因组DNA,应用恰当的DNA分析技术,便能鉴定出缺陷的基因,而不论该基因产物是否已经表达。而且,应用这一方法,不仅能够检测单个碱基置换、缺失和插入等,还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性。基因诊断检测的目标分

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    为科研实验而生  回复了帖子 每月细胞版风云战友奖励专用帖 351天前
    得分第九,谢谢版主
  • 为科研实验而生
    为科研实验而生  发布了新帖 Western免疫印迹(Western Blot) 353天前

    Western免疫印迹(Western Blot)   是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。一、原理   与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检

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